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这篇文章, 题目是《Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells》

文章发表在nature biotechnology杂志的2021年6月刊上

文章的题目，翻译成中文，意思是《大规模多模态地对单细胞的染色质可及性、基因表达、和蛋白水平进行扫描》

文章的通讯作者，是Peter Smibert，他是Immunai 功能基因组学的副总裁。他还是纽约基因组中心技术创新实验室的前主任。顺便说一下，Peter Smibert还是发明CITE-seq和ECCITE-seq的两篇论文的通讯作者。

研究背景

实验结果分析

实验内容的第一部分，开发并验证 ASAP-seq 方法

这是 ASAP-seq 方法的原理图。

先用带核酸链标签的抗体panel，

与被检测样本的细胞进行孵育，孵育过程中，抗体会和细胞上的抗原进行结合。

接下来，把细胞进行固定、和通透化。

通透化之后，用带了核酸标签接头Tn5的转座酶与被固定的细胞进行反应。

反应的结果，就是Tn5转座酶上面带的核酸标签，就会连接到染色体的DNA链开放区的位置。

然后，用一个桥接的寡核苷酸连到抗体的标签链上，

接下来进行10x的单细胞化，再建库、测序。

这里，是BOA接头的结构，和它的工作原理。

先看上面的抗体连的核酸标签。

这个标签链上，最右边是连到抗体上的。

标签链的中间紫色的这一段，是针对抗体的barcode序列。测序完成之后，就是用这段序列来识别对应的是哪个抗体。

标签链3’端是一段AAAA的序列，它的作用是模拟天然mRNA的poly(A)尾巴，与桥接接头的poly(T)粘上，并进行延伸反应

桥接接头，它的3’端是一连串的T，一共32个T碱基。这些T碱基，是与抗体的标签链上的poly(A)形成互补。它最后一个T碱基的3’端是被堵住的，不会发生延伸反应。

抗体标签链，与桥接接头退火粘上之后，抗体标签链就会延伸。

延伸的结果，就是把N9V这段序列加到了原来的抗体标签链上。这段N9V序列起到UMI序列的作用，用来识别这条核酸链在最一开始时，是来自于哪一个标签链分子的。

接下来，经过了延长的抗体标签链，再与凝胶微珠上的序列进行互补退火，并且再延伸。

再次延伸，就加上了凝胶微珠上带的细胞barcode，用来识别这条核酸链是来自哪个细胞的。

这是一个从液滴内的角度来看这个加barcode的过程。

右边的紫色的这段，是标记抗体的barcode，测序得到这段序列，就可以知道这是连到哪一种抗体上的。

中间，N9V，N9，就是9个随机的的碱基，这9个随机的碱基起到的是UMI的作用。

左边，灰色的序列，是连到ATAC微珠上的序列，

ATAC微珠的红色的序列，通过延长反应，就加入到标签链上。

红色的这段序列，就标示了这个微珠的身份信息。

除了BOA接头之外，作者还设计了BOB接头。

BOB接头的工作原理大体上与BOA的接头的工作原理相似，

但是BOB的接头上直接就接了UMI序列，

BOB接头粘上桥接接头，进行延伸

接着就可以与微珠上的DNA链退火，再延伸，

这样就可以加上cell barcode了。

接下来，作者想知道这个方法引起的双细胞的情况。

作者用小鼠和人，两个物种的细胞系做实验。用两个物种的细胞做实验的道理在于，可以通过基因序列，直接判断这是来自于人的序列，还是来自于小鼠的基因序列。

这里用的人的细胞系，是HEK-293T细胞；用的小鼠的细胞，是NIH-3T3细胞。

并且用的抗体也是物种特异的。

这里，左图，是染色质可及性的结果。

横轴是一个微滴中读到的人类的fragment数，

纵轴是一个微滴中读到的小鼠的fragment数。

用三种颜色来区分每个微滴中读到的是哪个物种的序列。

用红颜色标了是小鼠的微滴，用蓝色标了是人的细胞的微滴。混有两种物种的微粒，被用紫色标示。

这里，可以看到有2千多个人类单细胞，1千6百多个小鼠的单细胞，人和小鼠细胞混合的微滴有108个。

右图，是从测序得到的抗体的角度来看的结果，同样是用三种颜色，来标示，人、小鼠、混合，三种情况。

作者又比较了Pre-SPRI 和 Post SPRI的结果。

SPRI是指用磁珠来对得到的文库进行分选。

图中，蓝色的是SPRI分选前的效果，绿色的SPRI分选后的效果

可以看到，SPRI的分选，会对文库产生一些小的影响，但不会对文库产生大的影响。

作者比较了有蛋白标签的单细胞ATAC-seq，得到的开放位置，

和没有蛋白标签的ATAC-seq得到的开放位置。

图中，横轴上0就是转录起始的位置。

我们可以看到，左右两张图的形状很相似。也就是说，有蛋白标签，和没有蛋白标签，两者都到的效果是高度一致的。

这是根据ATAC-seq的数据制作出的UMAP图，再在图中，用颜色标出了各种蛋白在各个细胞上的表达量。

我们可以看到，CD4和CD8这两种蛋白，在细胞上的表达是互斥的，也就是表达CD4蛋白的细胞，就不表达CD8；反之，表达CD8蛋白的细胞就不表达CD4.

CD16在NK细胞上表达，CD14在与CD16不交叠的单核细胞上表达。

这是测序中，得到的线粒体的基因序列，并且在经过基因序列比对后，找到的基因突变。

可以看到，对线粒体基因分析的结果，可以很好地找到样本中存在的基因突变。

实验内容的第二部分，ASAP-seq是一个模块化的工具

作者要把ASAP-seq这个方法做成一个模块化的工具。那就需要检验这个方法与其它方法的兼容性、和一致性。

首先，作者要检验UBI是否能起到和UMI一样的作用，以及这两者之间的一致性。

所以，作者把含有UBI的接头，也就是TSB接头，与含有UMI的接头，也就是TSA接头，以一比一的比例，混在一起，对PBMC做实验。

这里,b图就是实验结果中，各个基因在细胞中的UMI数与UBI数的对比关系。这其中的每张小图中，如果图中绿色的点落在从左下角到右上角的对角线上，就说明UMI和UBI的一致性好。

反之，则说明一致性不好。

我们可以看到，大多数的点，是落在了对角线的附近，

Pearson相关系数r，是落在0.44到0.93之间。

这说明UBI是可靠地接近于UMI的。

作者接下来要确定用LLL和OMNI这两种透化方法，对最后能测到的线粒体的片段数的影响。

其中LLL是一种温和的透化方法，而OMNI是一种强的透化方法。

实验的结果显示，这两种透化方法，导致测到的线粒体片段数量的很大的差异。

用LLL，可以得到大量的线粒体的片段，

而用OMNI，得到的线粒体的片段数量很少。

这是两种透化方法，对几种蛋白的UBI数的影响，我们可以看到，这两种透化方法，对蛋白的UBI数的影响小。

实验内容的第三部分，ASAP-seq揭示了细胞的状态，以及骨髓中的细胞系

接下来，作者做了对骨髓细胞的分析。

操作流程如图，从一个健康人的骨头中取得骨髓细胞，

然后，用ASAP-seq的方法，测染色质可及性、线粒体突变、和一个蛋白panel中的蛋白含量.

最后是得到了10,928个高质量细胞的数据。

这是染色质可及性的UMAP图，染色质可及性把细胞分成了若干个亚细胞群

如作者所预期的，染色质可及性、和细胞表面蛋白之间是有相关性的。

这张图，横轴排列的是25个变化最大的细胞表面marker蛋白，

纵轴排列的是25个变化最大的转录因子。

图中蓝颜色是有负的相关性，红颜色是有正的相关性。

可以看到一些经典的相关性，例如：GATA1和红细胞的紧密关系，

CEBPA与骨髓细胞的紧密关系

这张图，是用蛋白做标记后，看细胞被分到细胞簇的百分比。

作者发现，用染色质可及性分细胞簇分得不好，但用蛋白marker来分，可以把细胞簇分得很好。

实验内容的第四部分，细胞分化期间的表面蛋白动态

作者假设把染色体可及性和蛋白标签整合起来，能够更好地理解造血过程中的细胞谱系的传递和分化。

为此，作者把CD34+并且CD38-的多能造血干细胞和祖细胞分析结果做成拟时序图。

这里，左边的图是多能造血干细胞的拟时序图。

可以看到细胞从中间向左上方的分化。

右边的图是祖细胞的拟时序图，

可以看到细胞从中间向右侧的分化。

这是单核细胞中，各蛋白标签在拟时图上的变化，可以看到多能的标签蛋白和祖细胞的标签蛋白，

例如：CD34,在轨迹一开始，就下调。

单核细胞的标签蛋白，例如：CD31和CD64,一开始就快速上调，然后在整个分化过程中都保持高水平。

而CD11c，则是在最后的时候上调。

在红细胞分化中，各标签蛋白在拟时序图上的变化也有类似的情况。

在单核细胞的分化过程中，大体上是一个基因的染色质可及性先提高，接着这个基因对应蛋白的表达提高。

这张图，是比较染色质可及性提高与蛋白表达提高的先后时间顺序。

横轴是基因的可及性的开放达到最高点的时间，

纵轴是蛋白表达到最高点的时间。

对角线左上方的，就是蛋白表达达到最高点晚于基因开放达到最高的时间点的，这样的基因有40个

对角线右下方的，就是蛋白表达达到最高点早于基因开放达到最高的时间点的，这样的基因有4个。

很明显，绝大多数的基因，是基因先开放，随后蛋白的表达升高。

实验内容的第五部分，ASAP-seq和CITE-seq揭示了三种调节

CITE-seq，是作者之前开发的另一种可以同时测细胞表面蛋白、和细胞RNA表达的单细胞测序方法。

作者想要看一看，把ASAP-seq和CITE-seq同时对样本做分析，会得出什么样的结果。

这张图，就是作者的设计出来的流程。

取PBMC细胞，一部分用抗CD28和抗CD3 的抗体，再加上IL-2，进行刺激培养16个小时；

另一部分细胞不进行刺激。

然后，用一个含227种抗体的panel染一下，

染过的细胞，两部分，分别做CITE-seq和ASAP-seq.

这是ASAP-seq和CITE-seq得到的UMAP图。

这里，上面的图是两种文库的复杂度的比较。

红的是ASAP-seq文库的结果，蓝的是CITE-seq文库的结果

如作者所预期的，

CITE-seq得到的文库复杂度，比ASAP-seq得到的文库的复杂度高，前者的分子复杂度约是后的1.7倍到2倍。

但是，两者的蛋白一致性较好。

这是比较ASAP-seq和CITE-seq测到的蛋白变化的一致性。

可以看到大多数的点都落在从左下方到右上方的对角线上，r值是0.95.

这说明这两种方法得到的细胞受刺激后，蛋白变化的趋势、变化程度，是高度相似的。

这张图，是展示受刺激、和没有受刺激的细胞，在三种模态上表现出的差异

染色质可及性的峰，15.8%有差异

mRNA的表达量，9.0%有差异

表面蛋白，31.3%有差异。

这与之前做的Bulk测序得到的结果是一致的。

作者举了CD3基因，作为一个例子，来说明三个模态的信息的意义。

可以看到，受刺激的样本中CD3蛋白明显比没有受刺激的要少许多，

但是在染色质可及性上，受刺激与没有受刺激的细胞，没有大的差别。

也就是说，加上蛋白的信息，可以看到更多的差异

实验内容的第六部分，DOGMA-seq让同时测细胞的4种模态成为可能

在作者推进工作的同时，10x公司推出了Multiome产品。Multiome产品可以同时测ATAC信息、和RNA转录信息。

这让作者想到，可以把作者自己之前做的CITE-seq和10x公司的Multiome的产品结合起来。

作者开发了新的DOGMA-seq单细胞测序方法。

这张图是DOGMA-seq方法的流程示意图。

和前面的ASAP-seq不同之处在于，这里，DOGMA-seq抗体上连的是带poly(A)尾巴的核酸标签。

在做了这样的改进之后，DOGMA测序就可以测到细胞表面蛋白的信息了。

而且，如果是用LLL这个方法做细胞的通透化，还可以测到线粒体的基因序列。

这是三种方法得ATAC的富集的位置。

可以看到，三种方法得到的ATAC富集的位置是高度相似的。

但是，DIG方法和LLL方法得到的ATAC复杂度

是低于Multiome方法的。

比较三种方法得到的线粒体的序列，

可以看到LLL方法得到的线粒体序列占的比较是较高的，

而DIG得到的线粒体的序列的比例是很低的。估计这与DIG是一种温和的透化方法有关，DIG不能裂解线粒体，所以得到的线粒体序列的占比就低。

得益于DIG方法是较为温和的透化剂，因此DIG方法保留了较多的细胞表面蛋白。

所以，测序结果中，DIG方法得到的蛋白标签的复杂度

高于LLL方法。

这是三种方法得到的表达的基因的数量，也就是测到的mRNA对应的基因的数量。

可以看到LLL方法和Multi方法，得到了较多的表达的基因的数量，

而DIG得到的基因数量较少。

接下来，作者把用LLL方法得到细胞的三个模态的数据，用权重最近邻居方法分细胞簇。

得到了25个细胞簇。

G图中，左边是对照组的细胞，右边是受刺激的细胞

H图，是把各组细胞标注了细胞类型得到的结果

这是，ATAC、RNA、细胞表面RNA，这三种模态的数据，分别对细胞分簇的贡献。

这是三个模态对细胞簇的区分，对比两个模态对细胞簇的区分。

作者举例，第17个细胞簇，在没有蛋白的数据时，是分不出来的。

只有在加入蛋白的信息后，第17个细胞簇才可以被区分出来

实验内容的第七部分，在原始的T细胞中复用CRISPR扰动

作者取CD4+ T细胞，进行CRISPR干扰。再结合Hashing方法对细胞进行分析。

被CRISPR干扰的基因是CD3E、CD4、ZAP70和NFKB2

这张图，是展示CRISPR干扰后，基因表达的改变，和蛋白含量的改变

横轴，是显示各个蛋白的含量的改变，向右是含量增加，向左是含量减少

纵轴，是RNA的表达量的变化。

可以看到有几个CD3E、CD4的点，是明显地偏到了图的左侧，说明这几个点代表蛋白含量有明显的下降。

值得注意的是，CD45、和CD69的点，偏到原点的上方，这是CRISPR干扰后，引起的相关的变化。

实验内容的第八部分，ASAP-seq让检测细胞内的蛋白成为可能

这是检测细胞内的蛋白含量的实验方法示意图。

作者先用针对细胞表面蛋白的TSA抗体Panel对PBMC细胞进行第一轮的抗体吸附。

接着对细胞做固定，然后对细胞做透化。

再接下来，用TSB的抗体Panel对细胞做第二轮的、针对细胞内部蛋白的抗体吸附，细胞内的目标蛋白被染上抗体。

接下来，染色体可及性等的实验操作是和前面一样的实验步骤。

这里，左边的b图，是测序后，得到的单细胞ATAC的UMAP图，并被标注上了细胞亚群所属的细胞类型。

C图，是经过数据分析，得到的细胞表面的几个特征的蛋白在各个单细胞上的表达情况。

D图，是细胞内部的几个特征蛋白的表达情况。

作者再进一步，看sgRNA干扰的效果，作者针对10个基因，每个基因用2个sgRNA，一共用20个sgRNA对细胞进行CRISPR干扰，再进行单细胞测序。

这是被干扰的10人基因。

这张图是被干扰后，测序得到的结果。

这是被干扰后，几个蛋白的含量情况

可以看到Ki-67这个蛋白，它是一个核蛋白，

在有刺激的时候，

比没有刺激时候的含量高许多。

而CD152，也就是CTLA-4，这个蛋白在细胞表面和细胞内都存在。现在，可以可以分开来检测这个蛋白在细胞表面的含量、和在细胞内部的含量了，而且分别都被检测到了。

在细胞表面的CD152中，还观察到它的分布不是连续的，也就是小提琴的形状，中间是一个很细的腰的。

总结