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这篇文章, 题目是：《Distinct immunological signatures discriminate severe COVID-19 from non-SARS-CoV-2-driven critical pneumonia》

这篇文章发表在Immunity杂的2021年7月刊上。

文章的题目，翻译成中文，意思是《不同的免疫学特征将严重的 COVID-19 与非 SARS-CoV-2 驱动的重症肺炎区分开来》

文章的通讯作者，是瑞士苏黎士大学，实验免疫学研究所的，Burkhard Becher教授

实验内容的第一部分，参与研究的病人情况

第一组，是新冠病人，被按照病情的严重程度，分成1到6，6个级别。

其中1到3级，被定为轻度；4到6级，被定为重度。

第二组，是25名因非新冠肺炎入住ICU的患者，并且这组患者都被归类为严重且需要有创机械通气的。这组病人也被称为HAP组

第三组，是21名健康人，作为对照组

患者在入院后第0天到第96天之间，多次采集了血样。

HAP组的患者在确认肺炎后的1-4天采集了一份血样。

而健康对照组的人，每人捐献了一次血样。

对样品做高参数的单细胞光谱流式细胞的分析。

作者用了三个有交叠的抗体panel来进行分析。

这种免疫分析方法，使作者能够评估：

1、PBMC的总体淋巴细胞和骨髓组成

2、T细胞亚群的相对丰度及其效应或记忆状态

3、B细胞分化水平

4、自然杀伤细胞的分化程度

5、单核细胞和树突状细胞亚群的相对丰度

6、淋巴细胞活化和衰竭的迹象

7、淋巴细胞产生的细胞因子

8、由淋巴细胞产生的细胞因子

实验内容的第二部分，免疫监测揭示了新冠的轻度、重度患者，医院获得性非新冠的肺炎患者的不同免疫状况

为了对轻度与重度新冠患者的循环免疫情况有一个概貌认识，作者使用基于 FlowSOM 的聚类分析了光谱流式细胞术数据。

这是得到的UMAP图。

这是新冠患者的PBMC中各种细胞的数量

这是用表面蛋白panel分析新冠患者与HAP患者的细胞亚群的PCA图。

可以看到健康人与患者之间有明显的分离

新冠的轻度患者，与重度患者，以及HAP患者，这三者之间有共享。

这是实验组之间来自每个白细胞亚群的免疫特征的比较。

目的是为了揭示与 HAP 的患者、感染性免疫特征不同的新冠患者的免疫失调。

这里，作者把轻度和重度的新冠患者之间Effect size的阈调到0.3。

可以看到，大量特征达到了0.3的阈值。这说明轻症和重症之间，有明显的免疫特征的差别。

再把HAP和新冠重症的患者之间的Effect size的阈值划到0.4，

可以看到，大量的特征值达到了0.4的阈值。这说明新冠重症与HAP之间，有更加明显的免疫特征的差别。

这表明轻度和重度的新冠患者表现出不同的免疫特征

这是已识别的免疫特征组中每个免疫区域的比例。

可以看到在T细胞、NK细胞、单核细胞和DC细胞中，都有严重的免疫改变。

实验内容的第三部分，严重病原体诱导的呼吸综合征之间共享的T细胞特征突出了新冠中的高炎症和耗竭亚群的出现

这是实验组之间来自每个白细胞亚群的免疫特征的比较。

左上角，这个框中红色的点，就是在新冠重症与轻症之间有差异的T细胞特征。

这是FlowSOM生成的免疫细胞簇的CD4和CD8箱图

在CD4的减少- CD8 -的，并且TCRγδ富集的T细胞的频率似乎是逐步进行的，在住院的第二周达到最低的

发现，PD-1在重度的新冠患者中的表达水平明显升高， 主要影响CD4+ T细胞这一部分。

这表明T辅助细胞免疫反应存在潜在的功能失调。

PD-1，在轻度的新冠患者的CD4+ T细胞中，相对于健康人，开始也有上升，

从第四周到到14周，恢复到正常水平。

相比之下，另一个抑制性受体CTLA-4的上调，发生在重度患者的后期阶段。

这些发现表明，所有重度患者有免疫T细胞的耗竭

为了搞清细胞因子极化的情况，短暂刺激细胞，再做细胞因子谱的分析。

来自新冠患者的受刺激淋巴样亚群的细胞因子谱，显示出显著更高量的IL-21, 并且颗粒酶B和穿孔素也升高，这表明向细胞毒性表型的转变。

比较轻度患者和重度患者，TNF、IL-4、IL-6、IL-17A在重度患者中的上升不明显，没有达到0.3的临界值。

IFN-gamma和IL-2, 在重度患者中的表达高于在轻度患者中的表达。

这两张图，图的横座标是新冠病情的严重程度

纵轴是目标细胞中，含GM-CSF为阳性的细胞数，

中间的红色区域，是含GM-CSF为阳性的细胞数量的趋势，

我们可以看到产生GM-CSF的CD4+和CD8+的细胞，与病情严重程度相关。

在没有离体刺激的情况下，对COVID-19患者的血细胞的单细胞RNA测序显示，

编码GM-CSF的CSF2基因，在CD4+T细胞中高表达

这是在GM-CSF的表达高与低的细胞中，免疫因子的表达。

红色的小提琴形状，代表的是GM-GCF低的情况，

绿色的小提琴形状，代表的是GM- GCF高的情况，

可以看到，这些免疫因子的表达的高低，与GM-CSF的表达高低有很大的相关性。

实验内容的第四部分，先天免疫特征的表型改变在严重的新冠和医院获得性非新冠肺炎患者中共享

作者进一步表征新冠与HAP共有的DC和NK细胞的特征。

图中的红框，是重度新冠与轻度新冠的差异大于阈值0.3,并且重度新冠与HAP患者的差异小于0.4的特征。

这其中蓝色的点是单核细胞和树突细胞的特征点，

黄色的点是NK细胞的特征点

这是所有样本的NK细胞的UMAP图

HLA-DR越低，表明细胞毒性反应减低。

这里，左图是比较HLA-DR在各个人群中的表达。

重度的新冠病人，低于轻度的新冠病人。

而HAP的人群的HLA-DR是最低的。

右图，是随时间进展，各个人群的HLA-DR的表达水平。

可以看到，t4这个时间点，轻度和重度的新冠患者的HLA-DR都降到最低点，然后在t5时间点，是有所回升。

这是浆细胞样树突细胞，也就是pDC细胞，在各个人群中的情况。

可以看到轻度和重度的新冠患者样本中pDC的细胞数减少。

而HAP患者样本中的减少更加严重。

为了在体外模拟新冠感染的效果，用R848来刺激PBMC细胞8小时。

其中R484是TLR7和TLR8的激动剂。

只有传统的树突状细胞2，也就是cDC2，的相关特征达到了新冠特异性的临界值。

因为树突状细胞CCR2表达是炎症的标志，并且需要它们迁移到发炎的肺，这可以解释树突状细胞侵入重度的新冠患者的肺部。

总而言之，患有严重的呼吸综合征的患者表现出细胞毒性减弱的迹象，同时NK细胞和树突状细胞的迁移增加，与潜在的病原体无关。

实验内容的第五部分，与其他呼吸道病原体相比，抗原呈递受损区分了对新冠的免疫反应

作者做了实验组之间来自每个白细胞亚群的免疫特征的比较

基于上述常见的骨髓特征，该区域内也存在重度新冠特有的表型变化

HLA-DR 和共刺激配体 CD86 在抗原呈递细胞 (APC) 亚群中的表达显着降低，这在整个研究过程中持续存在，并且轻度新冠患者并未达到这种程度

HLA-DR 和 CD86 的蛋白质表达，与 COVID-19 的严重程度呈负相关，这种关系在单核细胞中的重要性最高

实验内容的第六部分，新冠的独特特征是淋巴细胞隔室独有的

这是实验组之间来自每个白细胞亚群的免疫特征的比较。

图中展示了T细胞和NK细胞的特征。

这张图揭示了在重度新冠患者中，NKT细胞的显著减少。

而且这种减少在住院后第一周，也就是TPs 1和2这段时间内，就很显著了。

CD4+ EM 细胞对 PD-1 的更高表达是新冠独有的。

而且PD-1的高表达与病情的严重程度正相关。

再进一步分析，发现PDCD高 CD4+ 细胞与耗竭相关

图中，展示了各种与耗竭相关的基因的在PDCD高且CD4+的T细胞中的表达上升，

而与T细胞活化相关的基因的表达下降。

实验内容的第七部分，HLA概况将COVID-19免疫病理学与病毒识别受损联系起来

这张图，中间的大三角型是把新冠的轻度患者与重度患者的T细胞进行一致性比较的结果。

图中，一致性越高，格子的颜色就越偏向蓝色；一致性相反，就偏向红色。

作者发现适应性免疫，和先天免疫的不同，转化为髓细胞和T细胞的相关性，也就是1号区域的这些块

二号区域的这些块是髓细胞和NK细胞的关系

三号区域是T细胞和NK细胞的关系。

这张图是TP1 的免疫特征的相关图，与重度新冠患者相比

这种多组学方法使作者能够证明先天免疫系统的大多数严重的新冠相关免疫特征

红色箭头突出显示新冠的特异性免疫特征

实验内容的第8部分，体外刺激后CD4+ T细胞亚群中的ACE2表达增加

ACE2蛋白是新冠病毒进入细胞的受体。

ACE2蛋白在T细胞中的有CXCR3+和CCR6+的细胞中表达。

在CD4+细胞中，一个亚细胞群表达了ACE2

活化的CD4+ T细胞亚群上的ACE2，可能为病毒进入提供了一种机制。