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上课笔记|通过 LIBRA-seq 在康复期的新冠患者中快速分离和免疫分析新冠特异性记忆 B 细胞
发布日期：2021-08-27浏览：
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这篇文章, 题目是《Rapid isolation and immune profiling of SARS-CoV-2 specific memory B cell in convalescent COVID-19 patients via LIBRA-seq》。
文章发表在Signal Transduction and Targeted Therapy杂志的2021年5月刊上。
这篇文章的题目，翻译成中文，意思是《通过 LIBRA-seq 在康复期新冠患者中快速分离和免疫分析对新冠病毒有特异性记忆 B 细胞》
文章的通讯作者，是中山大学，公共卫生学院的陈耀庆教授。
实验结果分析
实验内容的第一部分，单细胞转录组分析揭示 B 细胞异质性概貌
作者从5名康复者的PBMC细胞中，先用Total-seq的方法，把5个康复者的PBMC细胞分别用带核酸标签的抗体进行标记。
接着，再用带荧光的抗原蛋白进行孵育，再用流式细胞仪对结合了荧光抗原的细胞进行分选。
接下来，把这些细胞用10x的方法建单细胞测序文库，
分别做单细胞RNA-seq、单细胞VDJ-seq、LIBRA-seq。
这样，得到单细胞的抗体克隆数据，接下来再做进一步的分析。
这是测序得到单细胞的t-SNE图，
细胞在测序后，被分成14个细胞簇。并且，5个康复者的单细胞的分布，没有大的差别。
这是几个特征基因，在五种B细胞中的表达情况。
可以看到：
1、幼稚B细胞的标志基因，IL4R和TCL1A
2、浆细胞的标志基因，XBP1和MZB1
3、记忆B细胞的CD27
为了定义B细胞亚群的转录组特征，作者鉴定了几个细胞亚群之间的差异表达基因。
在活化的记忆B细胞中，DHRS9、ACY3、和TYMS的表达水平高于记忆B细胞。
与活化的记忆 B 细胞相比，XBP1和MZB1在浆细胞中的表达更高
XBP1是 CREB-ATF 家族中的转录激活因子，对于增加浆细胞中的蛋白质合成至关重要
与记忆 B 细胞相比，PRDM1和IRF4在浆细胞中上调
这是幼稚B细胞和其它B细胞的表达差异。
可以看到，TCL1A和IL4R这两个基因是在幼稚B细胞中明显高表达，在别的B细胞亚细胞群中是低表达。
实验内容的第二部分，与记忆 B 细胞相比，活化的记忆 B 细胞具有更高比例的 SASRS-CoV-2 抗原标记细胞
为了揭示康复期患者的B细胞分特征，作者用单细胞测序分析了转录因子、抗原经历，细胞因子受体、激活相关基因、和细胞分化，这一系列的标记基因。
这张图展示的转录因子的表达差异。
可以看到KLF10、ZEB2、ZBTB32这三个基因在活化的记忆B细胞中高水平表达，并且显著高于其它B细胞亚群。
而且这种显著性，是P值小于万分之一。
CD11c和CD95，这两个基因是据报道与经历过抗原相关，并且与细胞类型切换相关。
这两个基因在活化的记忆B细胞中的特异性地表达。
趋化因子受体CXCR3，只在活化的记忆B细胞中表达。而CXCR3，在细胞向炎症部位迁移中起重要作用。
另一个趋化因子受体CXCR4，它控制进入解剖B细胞成熟位置，它在幼稚、记忆和激活的记忆B细胞中逐渐下调。并且P值小于万分之一。
CD86是激活的标志基因，它在浆细胞和活化记忆细胞的表达差异，达到了P值小于万分之一。
EBI3，在生发中心B细胞中表达，在作者这个研究项目中，它只在活化的记忆细胞中表达。
FRF5和CD40与人的B细胞活化、增殖和浆细胞分化相关。
我们可以看到，这两个基因在活化记忆B细胞中的表达水平最高。
作者接着用LIBRA-seq的方法找出抗新冠病毒的单克隆抗体。
LIBRA-seq的方法原理如图所示，用荧光染料、核苷酸标签序列标记抗原蛋白分子。
把康复者的PBMC细胞与标记过的抗原蛋白孵育，然后用流式细胞仪把带有荧光的细胞分选出来。
分选出来的细胞进行10X的单细胞建库测序。从一个单细胞中，同时得到抗体的重链序列、轻链序列、抗原蛋白的标签核苷酸序列。
这样就知道了一个单克隆抗体的配对的重链序列、轻链序列，以及这个单克隆抗体抗哪个抗原。
在作者的本次实验中，是把病毒S蛋白的RBD区域、S1区域，还有病毒核蛋白，都作为抗原，来进行捕获。
通过LIBRA-seq捕获到了235个单克隆抗体。
作者把这235个单克隆抗体回归到所属的B细胞的细胞亚群，并把每个单克隆抗体的标记量的高低，分成高、中、低三档。划分的线，分别是：
高于75%，在图中用红色表示
中等的，在75～25%之间，用绿色表示
低于25%。用褐色表示
图中，就展示了划分的结果。
左图是在各种细胞亚群中，有抗原标签的细胞比例。其中，红色的部分是带抗原标签的B细胞
可以看到，很明显，活化的记忆细胞中，有最高比例的带抗原标签的细胞。
而活化的记忆细胞，也就是高表达CD11c和CD95的细胞
从活化记忆B细胞中，挑有高水平抗原标签的，挑出10个，用HEK293细胞进行重组表达。
结果，10个重组的单抗中，有5个能在ELISA实验中与抗原有结合活性。
这张图，就是这5个有结合力的单抗的结合效果。
这是有、或无抗原标签的各种抗体在各个细胞亚群中的分布。
左边的i图是无抗原标签的情况，右边的j图是有抗原标签的情况。
可以看到，在没有抗原标签的抗体中，IGHG在幼稚的B细胞中的表达占比是0.8%，
而到了活化的记忆B细胞中，它的占比升高到了45.5%。
在有抗原标签的抗体中，相比于其它细胞亚群，活化的记忆B细胞中有最高的IGHG比例。
而IGHA在浆细胞中显示最高的占比。在有抗原标签的这一组中，这一点就更加明显。
接下来，作者分析各组细胞的抗体基因中的体细胞超空变。
体细胞超突变的反面指标就是抗体基因与胚胎抗体基因序列的一致性。
这张图是各组B细胞的抗体基因与胚胎抗体基因序列的一致性
没有抗原标记的这组，一致性的中值是95%
有抗原标记的这组，一致性的中值也是95%
还健康的对照组的，一致性中值是100%。
所以，康复患者中的体细胞突变是多于健康对照组的。
实验内容的第三部分，康复期 COVID-19 患者免疫球蛋白重链和轻链可变区基因片段的非随机配对
为了在单细胞水平上评估新冠患者的配对的BCR库的多样性，作者对记忆B细胞和浆细胞进行了单细胞VDJ测序。并且把没有产生重链或轻链的细胞过滤掉。
这样得到这样三张图。
A图是没有被抗原标记的细胞，
B图是有被抗原标记的细胞，
C图是健康对照者。
这三张图是各个抗体轻重链对，在三类种情况下的，各自在整个抗体库中的占比。其中
D图，是没有被新冠抗原标记的B细胞
E图，是有被新冠抗原标记的B细胞
F图，是C图是健康对照者
有趣的是，在没有抗体标签的这个抗体库，和健康对照都的抗体库中，都是IGHV3-23/IGHJ4这个抗体占据首位。
实验内容的第四部分，不同 COVID-19 个体共享的公共抗体克隆型的配对免疫球蛋白重链和轻链
这是从共开数据中得到的新冠病人的抗体的序列，我们可以看到，其中CV2、CV3、CV4、CV5之间的交叠关系。
实验内容的第五部分，通过高通量 LIBRA-seq 有效分离 SARS-CoV-2 反应性抗体
中和性抗体在治疗新冠中会有指导性意义，为此，作者用重组表达的方法，把LIBRA-seq得到的抗体基因序列表达重组抗体。
作者从235个有抗原标签的B细胞克隆中，找出41个理想的抗体基因进行表达。并且在没有抗原标签的细胞中，找出6个占主导地位的抗体基因，进行重组表达。
41个有抗原标签的抗体中，23个表现出了对新冠病毒的结合力；6个没有抗原标签的抗体中，有1个表现出了对新冠病毒的低的结合力。
这里，左图中表现这些抗体对病毒的S蛋白的RBD区域有结合力
右图中的这些抗体对病毒的核蛋白有结合力。
为了搞清楚对VH基因，也就是抗体的重链可变区，的利用情况，作者对这5个康复者的主要的抗体重链的基因做了发育树。
图中显示的，就是这个发育树。
右边列的这几个VH基因就是被利用得最多的HV基因。
其中IGHV3-53是被利用到最多的IGHV基因。
然后，作者专门挑了两个结合到RBD区域的单抗与伪病毒的结合力。
这两个单抗的结合力的IC50，也就是半抑制浓度，分别是0.65µg/ml和3.2µg/ml。
接下来，作者对两个单抗做了抗病毒对培养细胞侵噬空斑的实验。
左边e图，大家可以看到，0这个图，也就是当没有抗体，只有病毒时，培养细胞出现了明显的空斑。
而当加入抗体后，空斑的数量和面积都随着加入的抗体的增加而减少，当加入的抗体浓度达到16.6，甚至50µg/ml之后，空斑的数量和面积就很明显地减少了。
计算之后，得到这个抗体PRNT50的值是4.71µg/ml。和之前伪病毒实验得到IC50的3.2µg/ml是相近的。
对另一个抗体，C14646P3S的空斑实验，同样也可以看到随抗体浓度的增加，空斑的数量和面积都减小。
计算得到PRNT50的值是0.07µg/ml。这个值比之它的IC50的0.65µg/ml要低了一个数量级，也就是这个抗体的中和能力很强。
这个中和实验也体现出，用LIBRA-seq方法得到的抗体可以中和新冠病毒，对于开发抗体药物或疫苗，是很有用的。
