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这篇文章, 题目是《Small molecule-induced polymerization triggers degradation of BCL6》

文单发表在Nature杂志的2020年12月刊上。

文单的题目，翻译成中文，意思是《小分子诱导 BCL6 聚合并引发 BCL6 降解》

文章的通讯作者，是哈佛医学院的Benjamin L. Ebert教授。

实验内容的第一部分，BI-3802 诱导特定的 BCL6 降解

在科学家扫描BCL6的抑制剂的过程中，意外地发现了能导致BCL6蛋白降解的分子：BI-3802.

BI-3802的分子结构如图所示。

后面，会多次提到BI-3802这个化合物，为方便起见，后面我们会把这个化合物简称为B药。

另外，有一个与B药的化学结构很相近的化合物，BI-3812。这个BI-3812是BCL6的抑制剂，但不是BCL6的降解剂。这与B药是有差别的

作者拿SuDHL4细胞系，用B药进行处理后，用质谱来看各个蛋白的变化，

BCL6是唯一的含量严重下降的蛋白。

这是，用B药处理前后，细胞质、细胞核、染色质中有的BCL6的含量的电泳图。

B药让细胞质、细胞核、染色体中的BCL6蛋白大量减少

但是，与此同时，B药的处理，并不会降低BCL6这个基因的mRNA的表达量。

相比之下，BI-3812,并不降低细胞中BCL6的含量，

这与之前的B药会降低细胞中BCL6蛋白含量的特点，是完全不一样的。

为了搞清楚药物引起的BCL6的降低，作者设计了一个报告基因系统。

设计思路就如图所示。

在BCL6基因后面，直接跟了一个eGFP的荧光基因，eGFP会发出绿色荧光。

再隔着一个IRES结构单元，后面跟着一个mCherry。这其中IRES是一个可以让核糖体结合的序列，它的作用是让原来的一个转录本，可以有第二个翻译蛋白的起启位点。也就是让一个mRNA翻译出两个蛋白来。

而mCherry是一个会发出红色荧光的蛋白。

也就是说，这里的eGFP、和后面跟着的mCherry，都是起到报告用的荧光蛋白。

而且，如果没有BCL6带来的降解效应，那么理论上绿色的eGFP蛋白和红色的mCherry蛋白的数量应该是一样的

然后，来看几种特殊的化合物是否能够阻断，B药引起的BCL6的降解。

在这张图中，横轴是用流式细胞仪测到的BCL6蛋白所带的荧光标签的荧光强度。

纵轴上，从上到下排列了四组横向的条子，是用不同化合物的影响结果。每种化合物中，又分三条横向的条子，这三个条子分别是DMSO，也就是对照组，BI-3812，和B药。

第一组，我们可以看到，B药让BCL6蛋白大幅度减少，但是BCL的抑制剂，BI-3812，并没有让BCL6的蛋白大幅减少。

第二组，MLN7243，这是一个泛素激活酶UBAI的抑制剂。我们可以看到，这里，B药的结果和DMSO的结果是一样的。也就是说，当泛素通路被抑制时，BCL6蛋白的数量就不会因为有B药的存在而减少。

第三组，MLN4924，这是一个neddylation途径的抑制剂。Neddylation是指NEDD8蛋白结合到目标蛋白的过程，而NEDD8蛋白是一个类似泛素的蛋白。可以看到，在这个组里面，B药是会大幅减少BCL6蛋白的含量的。

第四组，MG132。这是一个26S蛋白酶体制剂。可以看到，当有MG132存在时，B药不会使BCL6蛋白的含量下降。

作者为了分析BCL6蛋白中，哪些区段对B药的作用是相关的，做了一系列的截短的重组BCL6蛋白。

然后，来看B药对它的们的降解作用。

结果如图，当保留前275个氨基酸的时候，B药的降解作用就是有效的，BCL6的蛋白含量是会有大幅下降的，

当保留的区域短于前275个氨基酸时，B药的降解作用就失效了。

而前275个氨基酸的区段，主要是BCL6蛋白中的BTB区段

实验内容的第二部分，BI-3802 诱导细胞 BCL6 光点

这是用B药对BCL6的前275个氨基酸片段的荧光的改变。

可以看到，在有B药时，出现了很明显的光点。

后来，这些光点又随时间延伸而逐步消失了。

这是用免疫荧光做的全长的天然的BCL6的情况。

可以看到，当有B药存在时，BCL6蛋白会聚集到一起，形成光点。

这是在截短到250个氨基酸的BCL6上做的实验。

我们可以看到，B药让BCL6聚集成光点，并且光点不随时间延长而消失。

也就是说，截短的BCL6蛋白，一方面还是会在B药的作用下聚集起来，同时，还不容易被降解。

而加入BI-3812这个竞争性的化合物，会让聚集起来的光点逐步消散掉，也就是说加入BI-3812这个抑制剂，会引起BCL6蛋白的降解。

实验内容的第三部分，BI-3802 诱导 BCL6 聚合

作者在用分子量排阻色谱柱纯化BCL6蛋白时，发现如果有B药存在，BCL6的分子就会更快地从色谱柱流出。

看这张分子量排阻色谱的图，当有B药时，这个粉红色的峰是提前出现了。而用DMSO或BI-3812时，没有出现BCL6提前流出。

因此，作者假设BCL6蛋白因为与B药结合，而形成了更高级的结构。

于是作者在电子显微镜下观察，看到当有B药时，BCL6会聚合成波浪样的聚合物，用作者的原话说，叫象正弦波的形状。

并且，这个正弦波样的东西，两个波峰之间的间距，是44纳米

接着，作者用计算机模拟BCL6相互连接的空间构象。

这里展示了模拟的各种情况。

注意一下，这个F2F的构象。也就是face to face的构象

作者把各种构象得到的大体样子放在这里，

这其中F2F的构象，也就是这中间绿色的这个构象，会得出峰和峰的间距44nm的这个结果。

也就是说，这个构象，是与电子显微镜下看到的波浪状的聚合物的形状是一致的。

这是BCL6的8聚体的样子。

其中B药正好嵌进BCL6的一条沟中，与蛋白中的Y58，也就是第58位的酪氨酸，相接触。

这方便了与相邻的另一个BCL6上的C84氨基酸以疏水的方式相互接触。

作者想要了解，BCL6中哪些氨基酸对与B药的结合是关键的

于是，对BCL6中从第32到第99个氨基酸进行用甘氨酸进行替代的突变扫描。

扫描的结果，发现E41A、G55A、Y58A、C84A这四个突变，能够大幅抵抗B药的降解作用。

作者为了了解BCL6的氨基酸序列会对形成聚合体有什么影响，做了几个BCL6的基因突变体。

图中，是这几个基因突变体的荧光图像。

最左边，是野生型的BCL6蛋白，可以在B药的作用下聚集成明显的光点。

中间：R28A、E41A、Y58A，这几个突变，BCL6就不会在B药的作用下聚合了。

最右边，C84A这个突变可以明显地减少细胞内光点的形成。

这里，是BI-3812和B药在蛋白的空间卡位上进行对比的结果。

图中，黄颜色的是B药，而橙色的是BI-3812。两种化合物的影象是部分重叠的

可以看到，橙色的BI-3812正好多出了一截，而多出来的这一截，正好与相邻的另一个BCL6蛋白造成了空间位阻。

这也是BI-3812这个化合物不会诱导形成BCL6蛋白聚合的原因。

实验内容的第四部分，SIAH1 参与聚合 BCL6 的降解

接着，作者用sgRNA库筛选的方法，来找出哪个基因对于B药降解BCL6是必需的。

作者用了两个方法。第一个方法如图所示。

用sgRNA文库转染HEK293T细胞。

用流式细胞仪对细胞进行分选，eGFP/mCherry的比例最高的5%的细胞，

和比例最低的5%的细胞被分出来。

eGFP比mCherry比例高，就是BCL6稳定，反之，比例低，就是BCL6不稳定。

图中左上角的这个三角型中包围的这些点所代表的细胞，就是BCL6最稳定的细胞；右下角的这个三角型中包围的细胞，就是BCL6最不稳定的细胞。

然后，通过单细胞测序，来看那些基因被sgRNA干扰后，会引起BCL6的稳定性的变化。

SIAH1和FBXO11这两个基因在火山图中的位置被标了出来。

再看4个针对SIAH1的sgRNA在BCL6稳定与不稳定的细胞中的测序read数。

可以看到，在BCL6稳定的细胞中，这4个sgRNA的测序read数明显更高，

而在BCL6不稳定的细胞中，这4个sgRNA的测序read数明显更低。

而且，没有B药的对照组细胞中，也是这个趋势。

接下来，是作者的第二个办法，目的是看细胞对B药的抗性

具体的做法是，先用sgRNA文库转染培养的细胞，

再用B药或DMSO来处理这些细胞。

最后，进行高通量测序，看哪些基因被sgRNA干扰后，细胞会对B药有抗性。

实验结果显示，

SIAH1这个基因，经过sgRNA扫描，在抗性实验，和报告基因扫描，这两个实验中都很突出的唯一一个基因。

SIAH1这个基因是一个E3连接酶，它参与泛素化和蛋白酶体介导的特定蛋白的降解。

为了证实SIAH1这个基因在B药对BCL6的降解过程中起到了作用，作者设计了几个sgRNA，这几个sgRNA都是针对SIAH1基因的。

从图中，我们可以看到，

最上面是阴性对照组的、不针对BCL6的sgRNA的效果，很明显，这个红色的条子显示，当有B药存在时，BCL6带的报告基因发出的红光，只有DMSO组的一半左右。

下面是6个针对BCL6的sgRNA的效果，我们可以看到这6个sgRNA形成的红色条子，BCL6带的报告基因发出的光，的强度都高于最上面那行的，无关的sgRNA组的结果。

这说明，针对SIAH1的6个sgRNA，都让BCL6变得更稳定

作者再做了过表达SIAH1，和把SIAH1突变，看对BCL6的量的改变。

过表达SIAH1基因，无论有或没有B药，都会降低BCL6蛋白的含量。

这也提示了SIAH1在内源性地对BCL6的降解作用。

而对SIAH1做失活突变，也就是C44S突变，能让BCL6蛋白的含量明显升高。

这都说明，SIAH1对降解BCL6有作用。

SIAH1这个E3连接酶，识别“VxP”的氨基酸序列。也就是先缬氨酸，中间任意一个氨基酸，再一个脯氨酸，这样的序列

而在BCL6中，第249到第251个氨基酸，是符合VxP这个氨基酸的主题序列的。

作者做了一个BCL6的变异体，包括BTB结构域，加上第241到第260个氨基酸的序列，其中包含了VxP序列

可以看到，SIAH1对这个BCL6的变异体的降解能起明显的作用。

作者用重组的BCL6的部分区段的肽段，在体外做实验，看BCL6被SIAH1泛素化，然后跑电泳。

可以看到这个肽段是SIAH1的底物，在被SIAH1处理的时间越久，就会被接上更多的泛素分子，在电泳上就会出现跑得慢的条带。

而加上了B药之后，跑得慢的条带变得更多，说明B药能够加速这种泛素化。

接下来，作者用时间分辨荧光看SIAH1与BCL6蛋白的相互作用。

左边的图是这个实验的工作原理。

SIAH1蛋白上标记了铽元素，

而BCL6蛋白上标了Bodipy这种荧光剂。

如果SIAH1蛋白与BCL6蛋白在空间上靠近，就会发生能量转移，发出波长为520纳米的荧光.

右边的图，是实验的结果。

当有B药时，520纳米的荧光很强，也就是说BCL6和SIAH蛋白在空间上靠得很近。

而加入的是BI-3812这种化合物时，和加DMSO的效果差不多。也就是说，BI-3812不会让BCL6蛋白与SIAH1蛋白更加靠近。

这是作者做的细胞内的BCL6与SIAH1的荧光照片。

这里，BCL6蛋白是加上了eGFP的荧光报告蛋白的融合蛋白

SIAH1蛋白是加上了V5蛋白的融合蛋白

我们可以看到，当没有B药存在时，BCL6和SIAH1都是弥散在整个细胞内的。

而当加入了B药后，BCL6就聚集成了光点，

同时SIAH1也聚集成光点

而BCL6的光点和SIAH1的光点，在空间上是重合的。