dafabet手机黄金版_dafabet黄金手机版

文章概要

研究背景

实验结果分析

实验内容的第一部分，人胸腺基质细胞的单细胞分析

把人的胚胎期、刚出生的胸腺组织，用酶解离后，用磁珠的方法去掉CD45+的细胞，用10x Genomics的方法做单细胞测序

把成年的胸腺组织用酶解离后，用流式细胞仪分选出CD45-的细胞，用10x Genomics的方法做单细胞测序。

这里说明一下，CD45分子在所有的白细胞上有表达，这里去掉CD45阳性的细胞，就是去掉白细胞，留下基底细胞做进一步的分析。

这是单细胞测序得到的UMAP图，一共是68,008个细胞。

右边的图注是这些细胞对应的发育时间点：怀孕19周，23周，出生后6天，10个月，成年25周岁。并且是颜色在UMAP图中进行了标示

对这些细胞进行无监督的聚类分析，得到12个细胞簇。

包括：3个上皮细胞簇，1个间质细胞簇，1个周细胞簇，1个动脉内皮细胞簇，2个静脉内此细胞簇，1个淋巴内皮细胞簇，1个血液红细胞簇，1个免疫细胞簇，1个间皮细胞簇

这是把细胞簇区分开的标志基因，用颜色标注到UMAP图上。

实验内容的第二部分，基质细胞提供对TEC发育和胸腺细胞迁移至关重要的互补因子

已经在动物模型中研究得知，神经嵴、间充间细胞和内皮细胞对一个胸腺生成的微环境很重要。但是人们对在人胸腺发育中的这些作用还知之甚少。

为此作者分析了WNT、BMP、转化生长因子beta(TGF beta)、胰岛素样生长因子（IGF）、和成纤维细胞生长因子（FGF）受体的表达信号传导途径。这些传导途径已经在别的科学家的研究中，被描述为TEC的发育和功有的关键调节因素。

分析表明，间充质细胞表达了这么关键途径中的许多配体和调节物，包括：WNT5A，RSPO3，SFRP2，IGF1和FGF10

而这些因子的受体在上皮细胞中被发现。包括：ROR1, ROR2, RYK, IGF1R, and FGFR2

值得注意的是，BMP4、FGF7、FRZB，在出生后，或成年后才高表达。

这表明间充质细胞的调节是随时间而变化的。

内皮细胞还表达了细胞外基质和粘附分子，例如纤连蛋白（FN1）和LGALS3，它们已被证明可调节胸腺细胞的迁移。

免疫荧光也证实了纤连蛋白FN在内皮细胞中的表达

间皮细胞也表达WNT信号的调节因子，RSPO1，RSPO3，SFRP2，SFRP5，另外还表达BMP4

周细胞表达FRZB以及WNT6，BMP5和FGF7

有趣的是INHBA基因最近被证明对TEC的分化很重要，而这个基因几乎完全由周细胞表达。。

实验内容的第三部分，对不同阶段的人类TEC进行分析

为了进一步定义上皮细胞簇中的异质性，将三个上皮细胞簇再进一步划分成9个亚细胞簇

并基于已知的TEC标记对这些亚细胞簇进行注释。

有两个亚细胞簇表达皮质TEC的特征基因，PSMB11, PRSS16, CCL25.

其中hi的这亚细胞簇表达这个三个基因的水平更高一些，lo这个亚细胞簇表达这三个基因的水平更低一些。

三个亚细胞簇表达髓质TEC的特征基因。

CLDN4在这三个亚细胞簇中都有表达

而在hi这个髓质TEC中，SPIB, AIRE, FEZF2三个基因有高表达

而在角质样细胞TEC中，KRT1和IVL两个基因有高表达。

作者还确定了一个标记为未成熟TEC的亚细胞簇。这个细胞簇表达经典的TEC细胞特征基因FOXN1， PAX9， SIX1,

但是缺少皮质TEC和髓质TEC的功能基因.

在所有的样本中都发现了这样的未成熟的细胞。它们可能代表了未变成特定细胞系的祖细胞，或随时间丧失了分化表型的细胞。

值得注意的是，在成年胸腺中检测到的cTECs或mTEC hi很少，表明存在未成熟TEC的积累，从而损害了老的组织中的功能性TEC。

免疫荧光分析支持了这一想法。显示出髓质中AIRE + mTEC hi的数量减少。

较老的组织中缺乏TECs的大皮质和髓质区域

最后，作者发现了另外三个亚细胞簇：

神经内分泌亚细胞簇，特征基因是BEX1，NEUROD1

肌肉样亚细胞簇，特征基因是MYOD1，DES

髓磷脂+亚细胞簇，特征基因是SOX10，MPZ

实验内容的第四部分，识别其他TEC标记

对未成熟TEC细胞簇进行再细化，得到2个亚细胞簇，把这两个亚细胞簇分别命名为TEC-1和TEC-2

有趣的是，成年人的细胞中有些未成熟TEC-2细胞有特征性基因表达，并且明显高于胎儿和刚出生后的组织。

如IGFBP5, NNMT, MAOA, DPYS, FKBP5,这些基因

非典型钙粘着蛋白基因CDH13在未成熟的TEC中富集，

并且通过免疫荧光在蛋白水平上证实了这个基因在TEC中的表达

接下来作者把他自己的数据和另外一个科学家Park的数据结合起来做分析。

发现锌指蛋白基因ZBED2在未成熟TEC和皮质TEC中高表达

调节TGF-β通路的基因在未成熟TEC和cTEC中高表达

这些基因包括：TDGF1、CTGF、IGFBP5、IGFBP6

过去的研究表明，KRT15基因只在干细胞来源胸腺上皮祖细胞中表达

在作者的研究中，KRT15基因在髓质TEC细胞中高表达，并且也在未成熟的TEC细胞中有表达。

免疫荧光证实，在皮质与髓质交界处有KRT8+并且KRT5+的细胞表达。

而在这个位置也有KRT15高表达的细胞。

流式细胞仪的分析证实，大部分的KRT15是在有表达KRT5或KRT8的细胞中共同表达的。

检测到，ASCL1基因在多个亚细胞簇中富集表达，而ASCL1是已知的在神经发育中起重要作用的基因。

在几个亚细胞簇中发现ASCL1的靶基因的表达

这些被发现有表达的靶基因包括：INSM1，DLL3，HES6，ST3GAL5，LYPD1和POU4F1

实验内容的第五部分，胸腺上皮部分中的细胞系决定

为了更好地理解不同上皮亚细胞簇之间的关系，作者用RNA速率分析做了RNA速率的拟时序分析。

RNA速率分析就是考虑没有被剪接的mRNA和已经被剪接的RNA之间的演进关系，以估计mRNA水平随时间变化，这个方法可以用于预测细胞状态之间转换的潜在方向性。

这个分析表明，cTEC低的这个亚细胞簇会变成cTEC高的这个亚细胞簇。

在胎儿期，cTEC低的这个亚细胞簇会变成不成熟的TEC；而在出生后，会倒过来，不成熟的TEC会变成cTEC低的亚细胞簇。

鉴于Notch信号传导在调节其它组织谱系选择，以及近来它在TEC中被描述的关键作用，作者检查了该途径中涉及的基因的表达，包括配体，受体，靶基因和抑制剂。

作者发现，DLL4是促进Notch1依赖性T细胞规格和成熟的关键配体，而JAG2是cTECs中表达的主要配体，而JAG1在未成熟的TECs和mTECs中被检测到

免疫荧光分析表明，在KRT15 + TEC中检测到HES1蛋白。

从而证实了Notch信号在这些TEC中是活跃的

在mTEChi中，发现TNFRSF4、TNFRSF9表达,这两个都是TNF的受体

P53信号通路的成员，PERP、SFN、CTSD、CDKN2A、CDKN2B，在角质样细胞中上调

在类似Toll的受体中，TLR1到TLR6、和TLR10在角质样细胞中上调

实验内容的第六部分，罕见的延髓上皮亚细胞簇的表征

为了对髓质TEC细胞簇进行更深入的了解，作者对髓质TEC、神经内分泌、肌样、髓磷脂表达细胞簇，这4个细胞簇进行细分聚类，得到8个亚细胞簇

研究中，确定了一个纤毛细胞群。这个细胞群是ATOH1, GFI1, LHX3, FOXJ1这几个基因阳性的。

纤毛细胞群之前有被报道过，但是是作者首先确定了这些罕见的细胞群的转录组数据。

发现了一个Myelin阳性的细胞群，这个细胞群类似于Schwann细胞。

确认了一个识别化学感应的一个细胞群

还确认了一个离子转运细胞群，这个细胞群的特征基因让人想起肺组织。

因为以前的文章没有报道过胸腺中存在离子转运细胞群，所以作者用免疫荧光的方法来证实这种离子转运细胞的存在。

就是存在CFRT和KRT8同时阳性的细胞，也存在CFTR和TRPM2同时阳性的细胞。

有趣的是，发现肌样细胞的标记物desmin和胎儿组织中的cytokeratin共染色，这表明肌样细胞可能是在胚胎发生过程中，由上皮细胞产生。

在角质样mTEC细胞、神经内分泌细胞、髓细胞中发现SOX2的表达。

已经知道SOX2在胚胎发生过程中有经典的表达，在增殖和分化中起关键作用，并且还参与许多成年组织中干细胞和祖细胞群体的维护工作，但是还从没有报道过它在出生后的胸腺中的作用。

免疫荧光实验证明SOX2在Hassall小体中表达

在K5+、K10+的细胞中，观察到SOX2的表达

这一发现很有趣，因为该因子通常是出生后祖细胞群体的长寿的标志，这表明这些结构可能比以前认为的更具动态性

实验内容的第七部分，TSA表达的特征

作者计算了TSA得分，也就是tissue-specific antigen score,中文意思是“组织特异性抗原得分”。

这张图就是整体的单细胞TSA得分，用UMAP图展示出来的效果。

分析表明，TSA得分在Aire基因高表达的mTEChi细胞中的得分高。

已知缺少了Aire基因的功能，会导致自身免疫疾病。

这是用UMAP图展示高TSA得分的细胞中正相关的基因。

大多数的抗原在AIRE+的mTEC细胞中被检测到。

这表明表达AIRE的细胞在自身免疫疾病中起作用

与1型糖尿病相关的基因，INS和GAD2，在稀少的AIRE细胞中表达

而与1型糖尿病相关的另一个基因，PTPRN，在少量的神经内分泌细胞中表达

编码乙酰胆碱受体（CHRNA1），肌肉抗原（TTN）和MUSK的基因与神经肌肉自身免疫性疾病重症肌无力有关，主要存在于肌样，神经内分泌和纤毛亚群中。

虽然这些细胞可能由于低水平的HLA I和II类表达而不会直接向胸腺细胞呈递抗原。它们可能通过向胸腺髓质中存在的抗原呈递细胞提供肽来参与免疫耐受的诱导。

总结