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文章的题目是《A spatially resolved brain region- and cell type- specific isoform atlas of the postnatal mouse brain》，

这篇文章发表在Nature Communications杂志的2020年1月刊上

文章的题目，直译成中文，是《出生后小鼠大脑的空间分辨的大脑区域和细胞类型特异性异构体图谱》

文章的通讯作者，是美国纽约州威尔康奈尔医科大学，脑与精神研究所和神经遗传学中心的科学家，Hagen U. Tilgner

实验内容的第一部分，出生7天海马和前额叶皮层组织的短读长序列将前体分配给已知的成熟细胞类型

作者先是对出生后7天的小鼠的脑子的海马体和前额叶皮层做单细胞RNA异构体测序

这张图是单细胞RNA异构体测序方法的框架。

先把细胞解离成单细胞，用10X的方法做成带单细胞barcode的cDNA，再分别做成短读长的测序文库，和长读长的测序文库。

短读长的文库用illumina的方法进行测序，长读长的文库用PacBio的方法进行测序。

短读长的文库，可以用来做对细胞的聚类。

长读长的文库用来拼出全长的RNA异构体。

然后进一步做深入的分析。

这是对单细胞进行聚类后得到的UMAP图，

左边是海马体的图，

右边是前额叶皮层的图。

C图，是RNA速度分析，也就是转录出来的RNA经过剪接变到成熟的mRNA的速度与方向，它揭示了神经元谱系处于不同的分化阶段

D图，是这些细胞在各分化阶段的计算得分，包括S阶段的得分，和G2M阶段的得分.

这是4个蛋白，分别在海马体和前额叶皮层的免疫组化染色，和对应的RNA表达的UMAP图。

实验内容的第二部分，从基因角度确定异构体的基因表达

DIE：Differential isoform express，翻译成中文，意思是“异构体表达差异”，指不同的细胞簇或细胞类别之间，RNA异构体表达量的差异。

这张图，作者把长测序得到的数据，进行反卷积分析，得到异构体数据，然后比较前额叶皮层与海马体之间的mRNA异构体的表达差异。

作者先用外显子的效用因子 (Δ Ψ）（psai）和P值，找到31个差异基因 

作者再用异构体的百分比的差异，也就是ΔΠ和P值，找到更多差异基因，有395个基因有显著性差异

这里，D图是前面分别基于外显子和基于异构体这样两个方法，分别找到的差异基因数据集的交叠情况。可以看到两者之间有25个基因是重合的。

异构体方法找到的395基因，对这其中每个基因的出现最多的两个异构体进行分析，找出了76个高可信度的新的异构体。

对这76个新的异构体进行分析，

40个是编码的转录本，

24个是无义突变导致的坏掉的转录本，

11个是保留了内含子的异构体，

还有一个是非编码基因。

这395个基因出现分析异构体的原因：

有141个基因是因为有不同的转录起始位点，或者不同的polyA位点。

剩下的254个基因，是因为使用了不同的剪接位点，导致出现异构体。

这是以Nsfl1c基因为例，说明异构体的情况。

横轴，就是整个基因的序列，粗的条子，就是经过剪接后保留下来的外显子。

从上到下，是按出现异构体的细胞簇进行排列

橙色的这些条子，是一个可变剪接的外显子的出现情况。

可以看到带这个橙色外显子的异构体，主要出现在海马体的神经和胶质细胞中，

但在前额叶皮层中，这个异构体很少出现。

这是以Nsmf为例，来说明异构体在各个细胞簇中的占比

横轴是各个细胞簇，

纵轴是出现的异构体类型

颜色则表示这种异构体在各个细胞簇中的占比。浅色是占比高，深色是占比低。

第一种异构体，主要出现在海马体中

第二种异构体，主要出现在前额叶皮层中，

这第二种异构体多了一个69个碱基的外显子，这个外显子是一个定位到细胞核的信号，并且是两个突触靶向的元素之一

第三种异构体，有这个69个碱基的外显子，但是少了前面6个碱基的一个小外显子。

这对出现在海马体中有利，但在神经元中完全不出现，这突显了这个小外显子在神经元的功能中起的作用。

实验内容的第三部分，跨脑区域的差异异构体表达主要受一种特定的细胞类型支配

基因表达的相似性把细胞分成等级。

首先是被分成神经元细胞，和非神经元细胞。

神经元又被分成兴奋型神经元、和抑制型神经元。

抑制型神经元比兴奋型神经元相互之间更加相似。作者把抑制型神经元分成抑制型神经元1、2、3，这样三个亚型。

作者把异构体在两个组织的兴奋与抑制神经元中的变化，分成三个模式。

第一个模式，是兴奋与抑制神经元这两种神经元，在海马和前额叶皮层两个组织中，都有变化。

第二个模式，在兴奋与抑制两种神经元中，只有一种是在两个组织中有变化。我们看到上面海马体中兴奋的神经元，与下面前额叶皮层中兴奋的神经元之间有变化，但在抑制的神经元中没有变化。

第三个模式，是两种神经元，在两个组织中都没有变化的。

接着，把之前得到395个有差异的基因，按照这三个模式进行分类。

在神经元和非神经元中有都异构体表达差异的基因数量，只有26个。

仅在神经元中有差异的，有151个。

仅在非神经元中有差异的，有81个。

剩下的137个，或者是属于模式3，也就是没有差异的，或者是reads数不够多，无法统计的。

这是基因的异构体占比变化，与细胞类型对照的热图。

这里一共取了5对细胞类型做对照。

横轴是基因，

纵向排列的是5个细胞类型对的比较

颜色表示变化程化，棕色是变化程度大，蓝色是指变化程度小。

每个大色块下面带一个窄的色彩条，这是指示差异属于哪种类型的

发现Hexa这个基因，在海马体与前额叶皮层有异构体的表达差异。

在海马体的兴奋性神经元中的异构体有80.9%是有这个黄颜色标出的外显子的，

但是到了前额叶皮层的兴奋性神经元中，就只有22.7%有这个黄颜色标出的外显子。

而Hexa基因是与泰伊-萨克斯氏病的相关的，这是一种与神经鞘脂代谢相关的隐性常染色体遗传病。

手工验证，发现这个异构体会导致一个无义突变，并且会导致蛋白质失去功能。

实验内容的第四部分，脑区可以通过微环境影响覆盖基因的子集的细胞类型特异性

ΔΠ是指异构体表达差异程度，这里把异构体表达差异大于0.1的基因占比，在各个细胞类型之间进行比较。

粉红色的柱子是指假设表达差异是独立的，那预期可能出现的ΔΠ的比例。

蓝色柱子是实际观察到的结果。

可以看中，实际观察值与期望值之间有很明显的差异。

神经元与非神经元之间，差异的P值少于2.2乘以e的负16次方。

实验内容的第五部分，一个大脑区域内源性的细胞类型具有独特的剪接特征

作者跟踪了单个细胞类型对大量DIE的贡献。发现73.4%是可以清楚地跟踪的。

以Fxyd1基因为例，海马体中的脉络纵上皮细胞，和前额叶皮层中的星形胶质细胞具有不同的剪接特征，从而导致区域性异构体表达差异。

实验内容的第六部分，脉络丛上皮细胞主要通过替代性转录起始位点产生独特的亚型

这是作者对各种细胞进行DIE比较，

左下角，是按粗的细胞分类，用4x4的矩阵来观察DIE。细胞被分成四个大类，血管、免疫、神经胶质细胞、神经元。

右上方，是把这四个大的细胞分类再分成更加细的细胞分类。

有趣的是，非神经元细胞比神元细胞，有更高的DIE。

图中，横轴是DIE的百分比，纵细是对应的细胞密度。

可以看到，粉红色的非神经元细胞，比灰绿色的神经元细胞有更高的DIE。

把非神经元细胞这部分再拆分看，可以看到其中脉络丛上皮细胞（CPE）有最高DIE分数。

而脉络丛细胞是脑室中分泌脑脊液的细胞。

并且脉络丛细胞的可变剪接与疾病相关。

令作者感到惊讶的是，转录起始位点的选择，在很大程度上解释了CPE细胞的异构体调节。

可以看到，与CPE相关的转录本，倾向于从更加上游的转录起始位点开始进行转录。

这可以允许CPE特定的转录后修饰、转录起始、和对基因表达的转录因子控制。

实验内容的第七部分，细胞类型之间DIE的单细胞基础

当两种细胞类型之间有DIE时，可能有两种情况。一种情况是两个类型的细胞各自有自己的异构体形式，另一种情况是每个类型的细胞，内部又有不同的异构体的表达。

作者以Nnat基因为例，来进行说明。Nnat，全称是Neuronatin，翻译成中文是“神经素”。这个基因在神经元有特别的异构体。

在室管膜细胞，和兴奋性神经元之间的差别，就是在室管膜细胞中，几乎都是一种型式，

而在兴奋性神经元中，都是另一种型式。

然而，在兴奋性神经元和颗粒神经母细胞之间的差别，就是颗粒神经母细胞中有一部分的细胞是与兴奋性神经元相似，另一部分不相似。

实验内容的第八部分，对长片段测序的数据进行聚类起到对短片段测序的细胞类型分配的概括作用

这两张图，是分别用长读长序列与短读长序列对细胞分类

这是对两种读长序列分出的细胞类型，做相似性对比的结果

例如：长读长序列可以区分神经元中的Pkm，和非神经元中的Pkm

长读长序列还可以区分出成熟神经元中的cdc42，和未成熟神经元中的cdc42

也有一些细胞类型，长读长序列不能完全分辨出来，例如成熟的粒性神经母细胞与不成熟的粒性神经母细胞

实验内容的第九部分，发育过程中相对异构体表达差异反映了功能的动态变化

作者用Slingshot方法，分析从放射状胶质样细胞（RGL，radial-glia-like）到兴奋性神元的过程。

其中，从RGL细胞到NIPC细胞（神经元中间祖细胞，neuronal intermediate progenitor cell）的过程只有5.1%的DIE，

而从NIPC到颗粒神经母细胞，DIE的比例增加到3倍，达到16.2%。

再后面从颗粒神经母细胞到兴奋性神经元，DIE的比例是14.61%

这是对这三步变化中，涉及的DIE基因做GO分析。各个颜色的长方块的大小对应于DIE基因的量。

随着颗粒母细胞向兴奋性神经元成熟，DIE与突触形成和轴突伸长有关。许多外显子包含水平发生了变化。

Camk2b基因的第11个外显子后面，多三个碱基，而把第12个外显子排除掉的这种异构体，这会把原来的缬氨酸替换成丙氨酸。

这个多3个碱基的形式，在胚胎期的不成熟的颗粒状神经母细胞中占主导地位。而在成熟的神经元中，这个多3个碱基的形式不是那么经常出现。

另外，橙色的这个第9号外显子，是一个可变剪接的外显子，这个外显子在分化的细胞中出现得更多。

实验内容的第十部分，海马丰富的发育基因成纤维细胞生长因子13（Fgf13）显示神经元亚型特异性替代转录起始位点（TSS）

Fgf13基因，全称是Fibroblast growth factor 13.

它在细胞内的作用是调节电压控制的钠离子能道。

这个基因没有信号肽，不向外分泌，它的蛋白在细胞内起作用。

它是一个神经发育的调节基因。如果做基因敲除，那是致死的。

它的mRNA有两种异构体，一种是从较下游开始转录，也就是S型；

另一种是较上游开始转录，也就是VY型

S型，是海马体内的主要形式，出现在兴奋性神经元，和不成熟的抑制性神经元中。

而VY型，是部分出现在DG神经母细胞中，在抑制性神元中占主导地位。

这是用原位杂交看Fgf13的两种异构形在切片中的出现位置

左边图，绿色的染色，是对Neurod6的染色，它是兴奋型神经元的marker基因；对Fgf13的两个异构体分别都用红颜色染色。可以看到S型这里，红绿两种颜色同一位置出现，说明S型异构体在兴奋性神经元中出现

右边图，绿色的染色，是对Gad2的染色，而Gad2是抑制性神经元的marker基因；对Faf13的两个异构体分别用红颜色染色，可以看到VY型这里，红绿两种颜色的共染色出现，说明VY型异构体在抑制性神经元中出现。

Fgf13两个异构体在细胞中的亚细胞定位不一样。

S型主要定位于核仁中，

VY型存在于整个细胞质中。

实验内容的第十一部分，与囊泡运输相关的突触基因在发育的海马神经元中显示出剪接差异

Snap25这个基因，有两个异构体。

在颗粒神经母细胞中，A型异构体有更高的丰度，

而在成熟的兴奋性神经元则转到是B型异构体。

实验内容的第十二部分，滑动异构体测序（sliso-Seq）来描述剪接变化的空间定位

作者对出生后8天的小鼠的大脑做矢状切面的空间转录组

空间转录组的结果，与短读长的单细胞测序，在空间上对齐、看数据，有85%的一致性。

Clta的空间表达与两种异构体，对应着神经元与非神经元的差异

Pkm的空间表达与两种异构体，也对应着神经元与非神经元的差异

这是Snap25基因在神经元发育中，从不成熟到成熟，对应着从a型异构体转到b型异构体的过程