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文章的题目是《The orchestrated cellular and molecular responses of the kidney to endotoxin define a precise sepsis timeline》,文章发表在elife杂志的2021年1月刊上。

文章的题目，翻译成中文，意思是《肾脏对内毒素精致协调的细胞和分子反应确定了精确的败血症时间表》

文章的通讯作者，是美国印第安纳大学医学院的医学教授，Pierre C. Dagher博士。

实验内容的第一部分，scRNA-seq可识别各种肾细胞群

作者用内毒素处理小鼠，在内毒素处理后的多个时间点取小鼠的肾细胞做单细胞转录组，取样的时间点分别是内毒素处理后的：0小时、1小时、4小时、16小时、27小时、36小时、和48小时。

把这些时间段得到的单细胞转录组合在一起，一共是得到了63,287个单细胞的单细胞转录组信息，

这里的UMAP图就是这6万多个细胞的整体展示结果。

有趣的是，UMAP图的空间排布和肾单位的正常肾小管节段有一致性。也就是UMAP图中的这条W形状的线，与下面图中展示的肾小管节段和细胞群，在顺序上有一致性。

这张图是把之前的UMAP图，还原到各个时间点的各自的UMAP图。

可以看到，各个时间点上，发生增殖的细胞是不同的。

在还没有被内毒素处理的基线，发生增殖的细胞位于肾小管的近端的细胞簇中。

在内毒素处理后的1小时，发生增殖的细胞主要位于S1细胞中。S1这个位置也是内毒素在肾脏上被吸收的位置。

在内毒素处理后的第16个小时，发生增殖的细胞主要位于淋巴细胞中。

在内毒素处理后的第36个小时，发生增殖的细胞主要位于S3细胞中。

这是用CldU来跟踪细胞的增殖。

CldU是“5-氯-2’-脱氧尿苷”的英文缩写。这种化合物是核苷的类似物，可以在DNA合成过程中掺入到新合成的细胞的DNA中。并可以通过荧光抗体染色，来显示新增殖的细胞的位置。

图中，0小时，和24小时，的两张图中的红点，就是CldU的被荧光抗体染色的位置。可以看到新增殖的细胞的位置的变化。0小时是肾小管近端细胞有增殖，内毒素处理后24小时，是肾小管旁的细胞有增殖。

发生增殖的细胞，在时间和空间上的变化，展示了肾脏对内毒素的反应，以及哪些细胞参与了这个受伤、修复、恢复的过程。

实验内容的第二部分，scRNA-seq和空间转录组学的整合定位S3近端小管的亚型

作者发现, S3T2这个细胞簇，表达几个特殊的基因，包括：

血管紧张素原,英文缩写就是Agt、Rnf24、Slc22a7、Slc22a13

可以看到，S3T2细胞簇几乎在整个内毒素血症过程中保持独特存在。

但是，因为不知道S3T2细胞在空间上处在什么位置，所以作者做空间转录组，来看S3T2细胞在空间上所处的位置。

这是小鼠肾脏的空间转录组。

把空间转组的结果与单细胞测序的结果进行整合，得到了15种细胞的点。

S3T2的细胞，也就是这种紫色的细胞的点，都集中在外延髓的外条纹处。

这是用单分子FISH实验检测Agt和Aqp1的空间位置

Agt就是血管紧张素原，用绿色荧光染色

Aqp1是水通道蛋白1，用红色荧光染色。

图中点状的绿色荧光是Agt，都集中在外延髓的外条纹。而血管紧张素原是S3T2细胞的特征表达基因，所以这也说明S3T2细胞的空间位置是处在外延髓的外条纹这里。

另外，图中弥散的绿色荧光，是红血球、和肾小管的自发荧光。

实验内容的第三部分，scRNA-seq的细胞轨迹和速度场分析表征了免疫细胞的亚群

在肾脏在受到内毒素处理后48小时内，免疫细胞增加5倍。

观察到两个不同的巨噬细胞簇，这两个巨簇细胞簇被分别标记为巨噬细胞A，和巨噬细胞B。

这是巨噬细胞A、B，和常规树状细胞，也就是cDC的特征基因表达情况。

可以看到，巨噬细胞A、B都表达巨噬细胞的标志基因Cd11b，差别在于巨噬细胞A表达Adgre1，而巨噬细胞B表达Ccr2。

可以看到，在免疫过程中，积累起来的主要要是巨噬细胞A。

在巨噬细胞A中，缺少细胞增殖的标志基因Cdk1和MKi67。

这增加了巨噬细胞A是浸润性的巨噬细胞类型的这种可能性。

巨噬细胞B，在UMPA图上它是介于巨噬细胞A和常规树状细胞之间。

从表达的基因上看，巨噬细胞B也表达H2-Ab1和Cd11c这两个常规树状细胞的marker基因。

这说明，巨噬细胞B，可能是介于巨噬细胞A和常规树状细胞之间的细胞类型

巨噬细胞B，表达Cdk1和MKi67这两个细胞增殖标志基因，所以巨噬细胞B可能会向巨噬细胞A和cDC细胞两个方向分化。

拟时序图的分析，和速度场分析得到的分化方向，在内毒素处理后1小时这个时间点，巨噬细胞B的分化方向是指向巨噬细胞A的，

而在内毒素处理后的36小时这个时间点，速度场分析得到的结果是巨噬细胞B的分化方向是指向常规树突状细胞的，而拟时序图是没有定论。

在内毒素处理后36小时，巨噬细胞A分成两个亚细胞簇。

其中一个亚细胞簇增加表达交替激活的巨噬细胞的marker基因，Arg1和Mrc1

在T细胞中，Cd8很鲁棒地表达

实验内容的第四部分，拟时序分析和速度场分析可确定沿内毒素血症时间线的细胞特异性表型变化

作者接下来检测了沿着败血症的时间轴，各种细胞的拟时序变化。

拟时序分析可以准确地预测实时观察到的未来状态。

内皮细胞最早在1小时的时候点就显示出状态变化。

S1细胞在较晚的时间点，4个小时的时候显示出变化。

重要的是，在16个小时的时候，是一个转折点，在这个时间点之后大多数细胞返回到它们的基线状态。

在后面的时间点上，许多细胞类型在获得新的细胞标记时失去了功能定义标记。

例如：S1和S3细胞丢失了经典标记基因Slc5a2和Aqp1。

并表达了与抗原呈递相关的新基因，如H2-Ab1和Cd74。

一开始，差别很大的S1细胞簇与S2/S3细胞簇，在第16小时的时侯，这三个细胞簇的基线合并成一个表型。

但RNA速度分析表明，S1细胞簇和S3细胞簇在RNA剪接上是不同的。而且在第个16小时的时候，S3细胞簇内部还分成两个亚细胞簇。

总体而言，16小时的时候，RNA速度场中观察到的明显变化表明剪接活性发生改变的重要性。

实验内容的第五部分，内毒素血症在肾脏中诱导全器官宿主防御表型

在内毒素处理的1小时内，大多数细胞类型显示参与核糖体功能、翻译和线粒体过程的特定基因的表达降低。这些降低在16小时达到峰值。并在27小时后恢复。

同时，大多数细胞类型表现出参与炎症和抗病毒反应的几种基因（例如Tnfsf9，Cxcl1，Ifit1和Irf7）表达增加。

实际上，这些基因的表达增加，在1小时内就在内皮细胞，巨噬细胞和周细胞/基质细胞中发生。这些细胞都起到第一反应者的作用。

相反，上皮细胞是晚期反应者。在4到16小时之间炎症和抗病毒反应增加

这是各个细胞簇在各时间点的GO分析。在内毒素处理的4小时之后，大多数细胞簇的GO特征并不明显。

有一个例外的细胞簇，就是S3T2这个细胞簇。它没有像其它细胞簇那样富集。

它在整个内毒素血症的时间轴上主要维持与核糖体、蛋白翻译和药物转运相关的表达谱。

这是各个细胞簇中，参与前列腺素通路和凝血因子通路的情况。

作者发现好几种细胞，包括：上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞和基质细胞，参与受伤后这些信号通路的信息流动。

由于NF-κB是TLR4-内毒素途径中的主要上游转录因子，因此作者通过免疫组织化学方法显示了它在肾脏中的时空表达

在基线时，NF-κB的表达在所有细胞类型中均最小，而且主要是在细胞质中。

内毒素处理后一小时，在大多数细胞类型中观察到NF-κB弥漫性核染色，主要在远端节段和一些近端小管中的间质细胞和免疫细胞中。

内毒素处理后四小时，核内NF-κB信号主要存在于间质细胞和免疫细胞中。

内毒素处理后16小时，核内NF-κB信号主要在近端小管中，呈现斑块状。此时，间质/免疫细胞中的NF-κB信号降低。

到27小时，NF-κB信号开始恢复到基线。

作者发现，在内毒素处理后48小时，S1细胞大部分恢复到基线水平，

同时，巨噬细胞显示参与吞噬作用，细胞运动和白三烯的基因表达增加。

可以看到Csf1r，Lst1，Alox5ap，这几个基因高表达。

实验内容的第六部分，内毒素血症改变细胞间通信，导致特定时间的全局通信减少

接下来，作者研究了内毒素血症时间轴上的细胞间通信。

A图是对右边图的图例说明，

右边图中，圆的外圈上，每个点就是一个配体，或者一个受体。并且每个点所在的位置对应于它所在的细胞簇。

每个点的高度，对应于其统计显著性。

圆中的线，就是细胞之间的通讯，线的颜色深度表示了这种通讯的强度。

对配体-受体通讯进行全面检查，

可以看到配体-受体信号会从一开始零时间的，基线的宽泛模式，

发展成在受内毒素处理后的4小时的时候的更加离散、更加专门的信号。

在处理后的16小时，各细胞类型之间的通讯急剧下降。这种通讯的急剧减少，可能导致了这个时间点细胞基因转录和翻译的关闭。

在作者的这个可逆的内毒素血症模型中，细胞间的通讯在27-48小时后恢复。

在整个内毒素血症时间轴上，S1和内皮细胞通过Angpt1和Tek配体-受体对进行通讯

C3在周细胞/基质细胞中强烈表达，而其受体C3ar1定位于巨噬细胞和DC细胞上。

另一个很强的通讯是内皮细胞和巨噬细胞、淋巴细胞之间，通过Ccl2和Ccr2这个配体-受体对进行的。

实验内容的第七部分，全局交流减少伴随着参与恢复的基因活性增加

令作者感到惊奇的是，在第16个小时细胞簇之间的通讯大幅下降的时候，关键的转录调节因子的表达增加。

例如：在S1细胞中，Sox4、Sox9、Hoxb7、Srf这几个关系到分化、发育、转录和增殖的转录调节因子的表达都增加了。

而这个时间点正好对应于蛋白翻译的关闭，和细胞与细胞之间的通讯的减少。

这是对第16个小时的表达谱的GO分析，可以看到转录、以及对转录的调控这两个条目是最突出的。

结合前一张幻灯片，在第16个小时的时候，这不仅是一个肾脏功能关闭的时间点，同时，这也是转向恢复、病愈的一个转折点。

实验内容的第八部分，小鼠内毒素血症时间线能用在人类败血症分期上

最后，作者想看一下，是否可以把小鼠的内毒素血症的时间线，用在人类急性败血症肾损伤的分层上。

这张图是用小鼠的数据应用于人类肾活检样本的基因表达谱，得到的把人类样本分为败血症早期、中期、晚期的结果。

作者设定了一个评分标准，叫“顺序器官衰竭评分”，sequential organ failure assessment score,缩写是SOFA。

结果证明SOFA分数与患者的临床败血症的严重程度密切相关。

病人的基因表达与小鼠内毒素血症后期的基因表达越一致的，则得分越低。