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文章的题目是《Repopulating Microglia Promote Brain Repair in an IL-6-Dependent Manner》,文章发表在Cell杂志的2020年5月刊上。

文章的题目，翻译成中文，意思是《重新填充小胶质细胞以依赖IL-6的方式促进大脑修复》

文章的通讯作者，是澳大利亚昆士兰大学，生物医学科学院的资深讲师，Jana Vukovic博士

实验内容的第一部分，消除小胶质细胞不会改善认知功能或者成年脑外伤后的神经发生

这是作者用药物来喂小鼠的时间轴。作者用P药喂实验组小鼠，在图中用黑色线来表示；并且同时用不含P药的食物喂对照组小鼠，在图中有绿色线来表示。

在喂了P药之后的三周，用受控的冲击，对小鼠的大脑皮质造成损伤，图中TBI是小鼠受控被脑外伤的时间点。

然后，在损伤后的6小时、3天、12天，分别取出小鼠的脑子做分析，看脑子中的表达Iba1蛋白的细胞的数量，而Iba1是小胶质细胞的marker基因。

这里，灰色的横线是没有受脑外伤的小鼠脑中的小胶质细胞的含量。

而绿色柱子，是没有被喂药物的对照组小鼠。可以看到，在脑外伤后脑中的小胶质细胞数量随时间快速增加。

而被喂食了P药的小鼠，也就是黑色柱子，很明显脑中小胶质细胞相对于绿色的对照组，要少许多。而且比灰色线表示的没有受脑外伤的组，也要少许多。

用荧光染色观P药2天，三种条件下的小鼠脑子海马区的Iba1+和Tmem119+的小胶质细胞，

Iba1和Tmem119都是小胶质细胞的marker基因

可以很明显地看到，用P药喂食的小鼠，在脑外伤后表达这两种marker基因的小胶质细胞明显减少，

相比之下做假手术的小鼠，和真的受脑外伤但不喂食P药的小鼠，小胶质细胞要多许多

作者设计了一个活动空间回避的实验，来检测小鼠的认知能力。

图中的这个圆盘，是一个持续转动的转盘，小鼠就被放在这个转盘中。

红线勾出来的这个扇形是一个静电电击区，当小鼠进入这个扇形区时，小鼠就会被静电电击。

圆盘的四边墙上，有视觉提示图案帮助小鼠来识别空间位置。

圆盘持续转动，要求小鼠根据墙上的视觉提示，不断地改变位置，以避免进入静电电击区而被电击。

也就是说，小鼠进入电击区的次数越少，则小鼠的认知学习能力越好；反之，如果进入电击区的次数多，则说明小鼠的认知学习能力差。

作者安排了四组小鼠，Sham组是假手术组，也就是没有受脑外伤的组，而TBI是真的受了脑外伤的组。

绿色的组吃没有药物的食物，黑色的是组是吃含有P药的食物。

根据是否真受脑外伤，和是否吃药物，排列组合，一共分成四组小鼠。

记录从受脑外伤后的第12天，到第16天，这5天时间内，4组小鼠的走动距离

这是四组小鼠走动距离的比较，可以看到，四组小鼠的走动距离没有明显的差异

也就是说，是否受脑外伤，和是否吃P药，对走动距离都没有明显的影响。

受脑外伤的小鼠，进入电击区的次数明显更多。

而是否吃P药，对受脑外伤、和没受脑外伤的小鼠，进入电击区的次数没有明显的差别。

也就是说，在这个条件下，脑外伤让小鼠的认知能力下降。而是否吃P药对认知能力没有显著的影响，也就是小胶质细胞的数量对认知能力没有显著的影响。

再看在5天的活动空间回避实验中，小鼠的空间认知有没有进步。也就是第5天相对于第1天，进入电击区域的次数有没有减少。

结果是，没有受脑外伤的，有明显的进步；而受了脑外伤的，没有进步。

受脑外伤的，与没有受脑外伤的，有很显著的差异

而吃或者没有吃P药，进步程度没有差异。

作者之前的工作已经揭示了小胶质细胞在调节成年大脑中神经干细胞、和祖细胞活性方面的重要作用，接下来要确定小胶质细的损失会如何影响脑外伤后的海马神经的发生。

作者用来做跟踪的标志物质是，

1、DCX基因，全称是 Doublecortin，中文名是微管相关蛋白双皮质素，是新生神经元的marker基因，作者用它看新生神经元的数量

2、Tbr2基因，全称是T-box brain protein 2，T盒脑蛋白2，是一种表达转录因子，它是中间神经祖细胞的marker基因，作者用它来看中间神经祖细胞池的大小

3、BrdU，溴脱氧尿苷，是一个核苷的类似物。当溴脱氧尿苷被注入小鼠体内后，就会掺入到新生成的细胞的DNA内，而溴脱氧尿苷可以被抗体识别，这样就方便用荧光标记的抗体来对掺入了溴脱氧尿苷的细胞进行荧光染色，并加以识别。有溴脱氧尿苷的细胞，就是新合成的细胞

4、EdU，全称是5-乙炔基-2’-脱氧尿苷。EdU会掺入到新合成的细胞的DNA中，可以通过与叠氮化合物反应，形成荧光基团，方便标记增殖细胞

有了前面所说的这些可跟踪的marker，接下来看实际的跟踪结果。

按是否受脑外伤，和是否喂食P药，把小鼠一共分4个组。

做手术的时间点被计为第0天，做手术后的第1、2、3天，每天被注射2次BrdU，到手术的第12天，被处死前2小时，被注射一次EdU

看DCX+细胞的比例的变化，可以看到，受脑外伤小鼠的DCX细胞的比例比做了假手术的小鼠显著减少，并且减少程度达到一半以上，DCX是是新生神经元的marker，也就是说新生的神经元细胞减少一半以上

而被喂了P药的小鼠，也就是小胶质细胞缺失的小鼠，DCX阳性的细胞比例进一步减少，也就是新生的神经元进一步减少

查看BrdU的跟踪结果，看到四组小鼠脑中的DCX+且BrdU+的细胞比例没有显著差异，

因为BrdU是显示新长出的神经元的，所以这个结果表明四组小鼠受伤后新长出的神经元的数量没有显著性差异

看Tbr2基因表达结果，可以看到有和没有P药处理，神经元前体细胞的总数没有显著差异

再看加上EdU跟踪的结果，可以看到有和没有P药处理，新生的神经元前体细胞的数量没有显著差异。

把上述几个结果综合一下，表明，

1、大脑区域去掉小胶质细胞，可能会干扰DCX+细胞的存活，

2、但大脑区域去掉小胶质细胞，对海马功能的行动结果的影响很小。

实验内容的第二部分，颅脑外伤后重生小胶质细胞可减轻空间学习障碍

接下来，作者用一个特制的转基因小鼠作为实验模型，先去除小胶质细胞，再让小胶质细胞重新长出来，看对小鼠空间认知能力的改变。

这个小鼠的转基因修饰较为复杂。基因修饰的细节，大家可以看这张表。

重点是：1、这个转基因小鼠可以在雌激素和白喉毒素的共同作用下，去掉小胶质细胞，而且这种调控是短期的，可以通过停药而让小胶质细胞重新生长

2、小胶质细胞表达发橙色荧光的tdTomato荧光蛋白，以方便跟踪

先用药物他莫昔芬来处理小鼠，他莫昔芬是一种类雌激素药物。他莫昔芬与白喉毒共同作用，可以去掉大部分小胶质细胞。

作者的实验设计是，在对小鼠做脑外伤实验之前42天开始，用他莫昔芬喂食小鼠，而对照组的小鼠喂食玉米油，

在对小鼠做脑外伤实验前三天开始，连续三天，每天都给小鼠注射白喉毒素。

然后，在脑外伤手术后的第1天，第3天，第12天，分别杀死小鼠，取出脑子进行分析

第1天，我们可以看到在白喉毒素处理的小鼠脑中，tdTomato荧光蛋白标示出来小胶质细胞很少，比旁边对照组的小胶质细胞少许多

第3天，小胶质细胞的数量有所恢复，

到第12天，小胶质细胞升到较高水平，高到与对照组接近的状态。

右边是定量分析tdTomato荧光强度的图，我们可以看到和左边荧光照片一致的结果，就是药物处理组的小胶质细胞，在一开始很少，到第3天就接近了假手术组，到第12天就和对照组很接近。

激光共聚焦的图像，证实发出红色荧光的表达tdTomado荧光蛋白的细胞，和发出绿色荧光的有表达Tmem119的细胞，是相同的细胞，而Tmem119是小胶质细胞的标志基因，这就证实了表达tdTomado荧光蛋白的细胞是小胶质细胞

令作者感到吃惊的是，小胶质细胞被恢复的小鼠，它的空间认知能力的缺失被缓解。

D图是小鼠在活动空间回避实验中，进入电击区的次数，进入次数越少，小鼠的空间认知能力越好。

浅灰色的线，就是只做了假手术的小鼠，进入的次数最少。

黄色的线，是经过脑外伤，但没有被药物处理的小鼠，也就是小胶质细胞没有被药物去除过的小鼠，进入电击区的次数最多。

蓝色的线，是先被药物处理，然后在脑外伤后，被停药的小鼠，也就是小胶质细胞得到重生的小鼠，这组小鼠进入电击区的次数是间于上述两者之间的。也就是说，小胶质细胞得到重生的小鼠，空间认知能力是相对于没有被药物处理的小鼠，是有所改善的。

这张图，是从手术后第1天小鼠进入电击区的次数，与第5天进入电击区的次数，进行比较，看小鼠学习进步的结果。

蓝色的这组，也就是小胶质细胞重生的这组小鼠，空间认知能力的进步水平，略小于灰色的、做了假手术的小鼠，但明显好于黄色的这组，也就是好于受了脑外伤，但小胶质细胞没有重生的这组小鼠。

接着，作者又把转盘的电击区改到对面图片对应的位置，看小鼠的认识进步情况。

如图所示，假手术组，和脑外伤但小胶质细胞重生的组，都有明显的学习进步。

而没有用药的脑外伤组，几乎没有进步。

这是小胶质细胞重生后，远期的结果。作者分别取了脑外伤后4个月和9个月两个时间点，

可以看到4个月后，小胶质细胞重生的小鼠，进入电击区的次数，要少于受脑外伤但没有被药物处理的组。

9个月，也是同样，小胶质细胞重生的小鼠，进入电击区的次数，要少于受脑外伤但没有被药物处理的组。

最后，为排除脑中其它细胞可能造成的干扰，作者直接向小鼠的海马区注射白喉毒素，以直接去除小胶质细胞。

图中是注射了白喉毒素后，小鼠大脑的海马区域内小胶质细胞的标志基因Iba1的表达情况，可以看到Iba1的表达变得很少。

接着，作者看小鼠的行为表现。

这里，TAM这组是直接注射白喉毒素的。可以看到，在脑外伤后第12天，它的认知能力是弱于做假手术组的，但是强于没有被注射白喉毒素组的。

看第12天到第16天，这5天之间的行为进步，可以看到，被注射白喉毒素的这组小鼠，5天内的行为进步程度，是低于假手术组，高于没有被注射白喉毒素组的。而且，是否注射白喉毒素，进步程度是有显著性差异的。

实验内容的第三部分，颅脑外伤后重生小胶质细胞可刺激功能性神经发生

DCX是新生神经元的marker基因。与前面实验所得到的结果一致，没有受白喉毒素处理的小鼠，在受脑外伤后脑中的DCX细胞减少了超过60%。

但是，令作者吃惊的是，受白喉毒素处理的小鼠，在受脑外伤后，在然后的小胶质细胞重生中，DCX细胞数量比受脑外伤但没有药物处理的小鼠脑中的DCX细胞多了一倍。

这证明，小胶质细胞的重生

用BrdU跟踪，揭示受伤后新生的神经元数量大大增加

海马中表达Tbr2的神经元前体也增加，而且加上EdU的跟踪说明这种前体的活性在增加

在脑外伤的急性期，使用药物方法诱导小胶质细胞更新时，DCX+细胞数目也有类似的增加

同时，还观察到了Tbr2+神经元前体细胞的变得更多，而Tbr2是中间神经祖细胞的marker基因，而且Tbr2+ EdU+细胞也变得更多，说明中间神经祖细胞不仅数量增加，而且活性也增加

为了完全排除外周或脱靶效应，作者把白喉毒素直接注射到小鼠脑子的海马体中，来局部诱导小胶质细胞的更新。

结果，看到这几张比较各组小鼠神经细胞的图，图中的蓝色的柱子都是比黄色的柱子高，也就是说小胶质细胞被去除，然后再被补充后，这对神经发生有好处。

接着，作者研究小鼠脑子里小胶质细胞重生后，相应的小鼠行为的改变。

可以看到，有重生小胶质细胞的小鼠，在注射白喉毒素之前，进入电击区的次数明显比没有药物处理的小鼠要少。

而在注射白喉毒素之后，进入电击区的次数与没有药物处理的小鼠没有明显差异。

实验内容的第四部分，通过IL-6反式信号介导的小胶质细胞重生的神经保护作用

已知脑外伤后，小胶质细胞会刺激功能性的神经生长，接着作者探寻介导神经生长的信号通路。

通过一系列的qPCR实验，发现脑外伤后第3天，IL-6是有显著的增加的，而且P值小于0.001.

同时注意到，IL-1β和CXCL1的在小胶质细胞中的表达明显减少。

再进一步探寻，发现在海马体中，与IL-6相关的IL6Ra、IL-6st、STAT3，表达量也升高。

作者为了证明重生的小胶质细胞对于IL-6表达很关键。做如下实验，三组小鼠

中间这组小鼠，先喂食玉米油、再用P药处理，脑外伤后2天，再用白喉毒素处理的这组小鼠，也就是这组小鼠是有重生的小胶质细胞的，脑外伤后第三天杀小鼠取脑组织做分析，发现它的IL-6表达是很明显地高于其它两组的。

其它两组，一组是没有喂食P药的，脑外伤后2天，用白喉毒素处理，也就说这组小鼠是没有重生的小胶质细胞，另一组小鼠是喂食他莫昔芬的，再用P药处理，脑外伤后2天，再用白喉毒素处理。这组小鼠中间是有重生的小胶质细胞，但后面用白喉毒素杀小胶质细胞，也是到最后是没小胶质细胞的。

这两组小鼠的IL-6的表达量都明显低于中间那组。

这个实验证明，重生的小胶质细胞对增加IL-6的表达很关键。

接着，作者做了一系列的荧光染色分析，蓝色组是用白喉毒素处理的，黄色组是没有用白喉毒素处理的对照组。

图中，绿色荧光是对IL-6的染色，

紫色荧光对是NeuN蛋白的染色，而NeuN基因是颗粒细胞的marker基因。

可以看到小胶质细胞重生的这个样本中，高亮度的绿色荧光点与高亮度的紫色荧光点紧紧地靠在一起。

比较白喉毒素处理的样本中的IL-6的含量，也有是有小胶质细胞重生的样本中的IL-6含量，与没有用白喉毒素处理的样本中的IL-6含量相比，可以看到有小胶质细胞重生的样本中IL-6的含量高了约一倍。

再比较两组样本中，IL-6的荧光强度与tdTomato的荧光强度，可以看到两组样本的荧光强度是差不多的，也就是说两组样本中，单个小胶质细胞上的IL-6数量是差不多的

再比较IL-6与NeuN的荧光强度的比值，可以看到小胶质细胞重生组的值，远远大于对照组的值。也就是说颗粒细胞是脑外伤后IL-6的主要的来源

作者在野生小鼠受到脑外伤后，在小鼠的海马中注入IL-6，看结果。

首先，有注入IL-6的小鼠在活动空间回避的实验中，进入电击区的次数显著少于对照组的小鼠。

其次，有注入IL-6的小鼠在5天的时间内，学习进步的水平显著高于对照组的小鼠

这说明了注入IL-6会改善小鼠的认知和学习能力

这是在野生小鼠受到脑外伤后，在小鼠的海马中注入IL-6，看小鼠海马的颗粒细胞中不成熟神经元数量的改变。

可以看到，受脑外伤的小鼠脑中的不成熟神经元明显少于做假手术的小鼠，

而受脑外伤的小鼠中，受IL-6注射的会比对照组的不成熟神经元数量多。

这说明注入IL-6有助于神经元的生成

作者接用着针对IL-6受体的抗体MR16-1在海马中对IL-6进行阻断，看会有什么效果。

用抗体阻断后，小鼠在活动空间回避实验中，进入电击区的次数显著增加。

5天时间内，没有学习进步

表达DCX的细胞的占比，明显下降。

用EdU和BrdU跟踪，发现新生的表达DCX的细胞显著减少，且活性下降。

作者要进一步确认IL-6所起的作用。就用IL-6受体被条件阻断的转基因小鼠来做实验。

这个转基因小鼠的特点是，它的IL-6受体基因被改造过，在IL-6受体基因的第4个外显子和第6个外显的两侧，有基因修饰，被插入了lox基因位点，而lox基因位点是可以被Cre重组酶切断的。

并且在Vav基因上也被做了改造，一个Vav基因的调控元件被连上了Cre重组酶基因。Vav是一个主要在小胶质细胞中表达的基因，Vav的调控元件连上了Cre重组酶，就可以让Cre重组酶在小胶质细胞中表达，并且进而切断IL-6受体基因中的lox位点，导致小胶质细胞中缺少IL-6受体蛋白。

然后，来看实验的结果，可以看到，

受脑外伤的小鼠中，如果是重生小胶质细胞的，而且是有cre酶的，也就是抑制了IL-6受体表达的小鼠，结果这种小鼠中DCX阳性的细胞数与没有重生小胶质细胞的差不多，而比没有cre酶的小鼠少许多。

而看EdU跟踪的结果，DCX+、并且Edu+的细胞比例，有cre酶的小鼠也比没有cre酶、但有重生小胶质细胞的小鼠少许多，

再看BrdU跟踪的结果，也是类似

这些证据说明，IL-6信号对于神经保护，和再生很重要，当没有了IL-6，神经元的再生会少许多。

IL-6的生物学效应非常复杂，因为它可以通过多种途径介导生物过程。经典的IL-6信号通路是在免疫细胞中，通过结合到膜上的IL-6受体，IL-6受体再与信号转导亚基gp130结合，启动下游事件，这样起作用。

但IL-6也可以在不表达IL-6受体的细胞中起作用，这是通过可溶的IL-6受体从膜上脱落后，在细胞外与IL-6结合，而各种细胞都表达gp130蛋白，IL-6与IL-6受体的复合物与各种细胞的gp130再结合，这样起作用。这种作用方式叫作“反式信号通路”。

那么，为了确定脑中小胶质细胞中，IL-6是通过经典信号通路起作用，还是通过反式信号通路起作用，作者就把可溶性gp130-FC蛋白作为工具，注射到小鼠脑中。

可溶性gp130-FC蛋白，是一种只阻断IL-6反式信号通路的蛋白。

作者发现，注射了这种蛋白后，受脑外伤的小鼠的海马体中完全没了小胶质细胞重生带来的行为上的好处。也就是小鼠进入电击区的次数明显增多。

而且这种小鼠，在5天的时间内，没有认知进步

前面一张幻灯片是行为的结果，这张是在神经元上结果，

可以看到在有gp130-FC处理后，表达DCX细胞的数量也明显减少。

这就表明IL-6是可以通过反式信号通路在海马体内起作用的。

接着，作者又通过给小鼠注射hyper-IL-6来进一步验证。

Hyper-IL-6是IL-6和可溶性IL-6受体，两个基因做出来的融合蛋白，它的作用是可以通过反式信号通路刺激表达gp130蛋白的细胞。

实验结果显示，Hyper-IL-6是可以起到让DCX细胞相对于对照组增加的作用的，

并且增加的程度与单纯用IL-6差不多，

而且这种增加作用不会被针对IL-6受体的抗体所阻断。

这也就进一步证明了IL-6对小胶质细胞重生的作用。

实验内容的第五部分，重生小胶质细胞具有独特的转录谱并在颅脑外伤后调节微环境

作者在转录水平上研究了重生的小胶质细胞可以发挥神经保护作用的基因表达。

这个转基因小鼠，报告因子tdTomato永久标记了大脑中的小胶质细胞。然后进行白喉毒素的处理，再通过荧光激活细胞分选技术，从海马中分离出标记了tdTomato+小胶质细胞，RNA-seq深度测序后，分析基因表达的差异。

这张图，就是基因表达差异的火山图，比较的是用白喉毒素进行小胶质细胞重生，和用生理盐水做的对照实验。

一共发现了3146个有表达差异的基因。

把这些有表达差异的基因，做通路分析，这里展示的前12个有显著差异的通路。

包括了损伤模式的识别，和干扰素信号，还有细胞增殖。

再看上游调节因子预测方法来分析得到的结果，图中，蓝色的条子是被下调的通路，红色的条子是被上调的通路

可以看到几个干扰素因子的通路被下调，包括：IFN-alpha, IRF7, STAT1, IRF3, IFNAR和IFNB1

而STAT3通路是被显著上调的。

上述的这些实验结果表明：受脑外伤的大脑中重生的小胶质细胞群的基因表达谱与原始的小胶质细胞群在根本上是不同的，主要的变化是重生的细胞的反应性降低，而增殖状态增强。

小鼠在没有受脑外伤时，小胶质细胞不影响认知能力。

而当小鼠受脑外伤后，重生的小胶质细胞会帮助缓解学习能力的缺失

重生的小胶质细胞重塑大脑的微环境，并诱导IL-6保护神经，促进神经生长