dafabet手机黄金版_dafabet黄金手机版

文章的通讯作者，是诺华生物医学研究所高级首席科学家，Viviana Cremasco博士

研究背景

实验内容的第一部分，单细胞RNA-seq分析揭示了癌症相关成纤维细胞不同亚群的存在

实验流程如下：4T1是一种鼠的乳腺癌，它有很高的基质生成响应，并且是免疫排斥的。

把4T1肿瘤细胞种到雌性小鼠的皮下。

在肿瘤长到700立方毫米的时候，把肿瘤切下来，并解离成单细胞

用针对CD90和CD31的抗体磁珠，把有CD31和CD90的细胞富集出来

用10X Genomics的办法做单细胞测序文库，

进行高通量测序，再进行数据分析。

这是测序后，生物信息学分析得到的tSNE图，各个细胞簇根据典型的细胞标记基因进行了注释。

这里蓝绿色的这部分是CAF细胞簇

这是各个细胞簇表达的特征基因，

其中CAF，也就是cancer associated fibroblast，肿瘤相关的成纤维细胞，是本项研究中被特别的关注的对象。

CAF细胞簇又被进一步划分成4个亚细胞簇

这是对CAF亚细胞簇用主成份分析，得到的结果。

图中，每一个点代表每一个样本的一个亚细胞簇。因为是5个样本，所以每种颜色有5个点。

可以看到，第一个主成份，就把第一个亚细胞簇与另外三个亚细胞簇给分开了。

绿色代表的第一个亚细胞簇，与另外三个亚细胞簇有明显的差别，

把4个亚细胞簇的基因表达特征，用小提琴图表示出来，如图所示。

Fap和Thy1基因是典型的成纤维细胞的marker基因，这两个基因在4个亚细胞簇中都有表达。

Acta2基因对4个亚细胞簇有很明显的区分作用，它在第一簇中，很少有表达，而在其它三个簇中有高表达。Acta2基因编码平滑肌肌动蛋白，所以这提示第一个亚细胞簇的收缩能力很少。

第一个簇，高表达白介素6、补体3、和CD34，这些分子都与肿瘤中的病理性炎症有关。

第二个簇，大量表达细胞外基质重塑的基因，包括：Mfap4、Lrrc15、Tagln。

第三个簇，高表达促血管生成分子Vegfa，还大量表达胶原交连蛋白LOX

第四个簇，是唯一表达Mki67的簇。这个基因与细胞增殖有关，这提示这个亚细胞簇代表了肿瘤微环境中，成纤维细胞增殖的细胞群。

作者在其它几种肿瘤中，也同样发现成纤维细胞分成几个亚细胞簇。

这三张图，是三种鼠类的癌组织中的成纤维细胞分成亚细胞簇的情况。

实验内容的第二部分，CAF异质性反映细胞功能专业化

把4个亚细胞簇的高表达基因，进行功能富集。

可以看到第1个簇，在炎症、免疫细胞调控，包括细胞因子、趋化因子，方面有富集。这个亚细胞簇可能是主要参与免疫调控方面的工作的

第2个簇，在基质沉淀方面有富集，提示这些细胞在构建肿瘤的框架、形成基质方面起作用，编码各种胶原蛋白的基因高表达，并且对基质有塑形作用的ADAM基因家族、MMP基因家族有广泛的表达

第3个簇，在调节代谢方面有富集

第4个簇，在细胞周期相关的基因方面有富集

实验内容的第三部分，TGFβ阻断在肿瘤微环境中干扰成纤维细胞活性

之前，已有别的科学家的研究，提示TGF beta在与肿瘤相关的成纤维细胞中起多种作用，特别是与肌成纤维细胞的分化和在肿瘤中的功能有关。

作者分析了四个亚细胞簇中的TGF beta信号通路中的各个基因的表达情况。

高表达TGF beta基因家族的细胞，主要集中在第2、3、4，这三个亚细胞簇中。

这提示这三个亚细胞簇可能是肿瘤微环境中主要的表达TGF beta的成纤维细胞来源。

而TGF beta的受体，在四个亚细胞簇中都有表达，尽管表达的水平有变化。

值得注意的是，Dcn在第一个亚细胞簇中明显高表达。Dcn是组成胶原蛋白的成份之一。有报导，TGF beta 1会下调成纤维细胞中的Dcn的表达。而Dcn对TGF beta有负调节作用

在第一个亚细胞簇中，Ltbp1（潜在的转化生长因子beta结合蛋白1）和Thbs1（血栓反应蛋白1）高表达，Ltbp1会与TGF beta结合，Thbs1也会与TGF beta结合。这提示第一个亚细胞簇有一个潜在的作用，就是调节TGF beta的可得性。

这是TGFβ基因在四个亚细胞簇中的表达情况，很显然它在第一个亚细胞簇中的表达水平是最低的。

之前的数据促使作者研究TGFβ阻断剂对体内的CAF的表型和功能的相对影响。

这是TGFβ/SMAD发光系统实验的原理图，TGFβ会激活SMAD信号通路，SMAD信号通路中的下游信号被串联激活，最后启动对发光蛋白的表达。再看发光蛋白引起的发光强度，反过来推断TGFβ的活性。

被种了4T1肿瘤的小鼠，用针对TGFβ的阻断抗体来进行处理，同时用同型抗体做对照组。取小鼠的血清，加入到有发光基因的培养细胞中，看结果

左图中，有阻断抗体，发光强度低；

用同型抗体做的实验，也就是对照组，发光强度高。这支持了阻断抗体有中和TGFβ的作用的判断

右图中，有阻断抗体，肿瘤的重量小；

对照组，肿瘤的重量大。这说明阻断TGFβ能够减缓肿瘤的生长。

这是有阻断抗体处理的肿瘤RNA表达的改变。

可以看到与肌成纤维细胞活性和细胞外基质相关的基因，包括Acta2，Mfap4和Lrrc15的基因表达明显减弱

与这些发现一致，抗TGFβ处理的小鼠的肿瘤中促纤维化基因表达实质性减少，这是通过分析与胶原蛋白沉积和纤维化相关的基因特征证明的

总之，这些数据表明针对性阻断TGFβ，会影响肿瘤微环境中的成纤维细胞动力学。

实验内容的第四部分，TGFβ阻滞改变肿瘤胶原蛋白的沉积和网状纤维的形成

这是4T1肿瘤在激光共聚焦的下看到的图像，

下面是有抗TGFβ的抗体阻断的结果，

上面是同型抗体做的对照结果。

蓝色的荧光是DAPI,

绿色荧光是ERTR7，ERTR7是一种定位在网状成纤维细胞的胞浆中的蛋白，

白色荧光是alpha SMA，也就是alpha 平滑肌肌动蛋白。

观察alpha SMA，可以看到，用针对TGFβ的抗体做阻断处理后，成纤维细胞网络发生了显着变化，缺乏细长的纺锤形细胞，并且其中的纤维网状组织减少

分析ERTR7，还显示，肿瘤内的结构组织发生了显着变化，这说明在用TGFβ阻断抗体治疗的小鼠中，原来由纤维组成的高度网状的网络丢失了

这是用双光子断层扫描来看胶原蛋白骨架的图像。

可以看到用阻断抗体处理的样本，胶原蛋白骨架形成整体损伤。

相比之下，对照组的肿瘤组织中有致密的胶原结构，并且在主要方向上有组织地按模式排列。

这表明阻断TGFβ会损害成肌纤维细胞功能，导致肿瘤胶原框架的不稳定

这是用单细胞测序，来分析哪些细胞受抗体阻断的影响最大。

这里，横轴是平均的TGF beta 受体表达水平的变化，

纵轴是受到影响的基因数量，

可以看到CAF细胞簇处在这张图的最右上方，

也就是说CAF细胞中，TGF beta 受体表达水平的变化最大，并且受到影响的基因数量也最多。

实验内容的第五部分，TGFβ阻断导致myCAF丧失和CD73+ 成纤维细胞的出现

已知抗体阻断会对CAF细胞产生很大的影响，作者继续对CAF的各亚细胞簇做分析。

这里，右边是用针对TGF beta抗体进行阻断的结果，

左边是对照组的结果。每组各4只小鼠，每条柱子代表一个小鼠的情况。

可以看到，有抗体阻断的这组，myCAF和vCAF的细胞明显减少，这表明这两种亚细胞簇对在肿瘤微环境中对针对TGF beta进行抗体阻断很敏感

而多出了ilCAF细胞，也就是图中紫色的这群细胞，

英文全名是interferon-licensed CAF，翻成中文意思是干扰素许可的CAF细胞

这是用流式细胞仪来检测表达αSMA的CAFs细胞数量，

可以看到表达αSMA的细胞，也就是成肌纤维细胞数量，明显减少

ilCAF亚细胞簇，

特征性表达Nt5e基因，

而其它四个亚细胞簇不表达Nt5e基因。

ilCAF细胞，还特征性地表达CD73蛋白。

用流式细胞仪来跟踪CD73来看抗TGF beta抗体阻断的样本，发现被阻断的样本中，表达CD73的细胞数量大幅升高。

这是CAF细胞的拟时序图，图中有两种别细胞，延两种轨迹变成ilCAF，

一种是成肌纤维细胞变到ilCAF,

另一种是间质细胞前体在没有TGF beta的信号时变到ilCAF.

也有可能，就是ilCAF与myCAF分别代表CAF细胞的两种功能状态。

但还需要进一步的研究，来证验这些假设。

实验内容的第六部分，TGFβ阻断后产生的成纤维细胞是干扰素许可的CAF

ilCAF亚细胞簇在干扰素作用下，有差异表达的基因，

有许多鸟苷酸结合蛋白家族的基因高表达，也就是这些名字以Gbp开头的基因。

还观察到干扰素反应性基因的高表达，包括：Cxcl9、10、11。

ilCAF亚细胞簇中，

干扰素应答信号通路的基因表达上调，

抗原加工和呈递的基因表达上调

小鼠体内进行TGFβ阻断后，检测到在CAFs中MHCII蛋白上调

4T1肿瘤是乳腺癌，作者为了研究内分泌的激素是否会影响基质微环境，在雌性小鼠的乳腺脂肪垫上种4T1肿瘤。

然后，用抗TGF beta的抗体来处理，

发现在阻断抗体的作用下，肿瘤的生长被延缓，

这与皮下种肿瘤得到的效果是相似的。

这单细胞RNA-seq得到的t-SNE图，

种在乳腺脂肪垫上的肿瘤得到的细胞分类，

和在皮下种的肿瘤的细胞分类是类似的。

种在乳腺上的，多了一个乳腺细胞的亚群。

在阻断抗体作用下，

种在乳腺脂肪垫上的肿瘤中myCAF和vCAF两个亚细胞簇也明显减少。

这与在皮下种的肿瘤细胞是一样的。

这是在蛋白水平上，

比较皮下种植肿瘤，

和乳腺脂肪垫上肿植的肿瘤，看蛋白表达的情况。

可以看到alpha SMA、和CD73，都高度相似

上述这些发现支持以下的假设，就是CAF的异质性及其对TGFβ的反应可能代表了与成纤维细胞本身来源无关的普遍现象，也就是说这与是皮下组织的成纤维细胞，还是乳腺组织的成纤维细胞无关。

前面看的，都是在小鼠模型上的实验结果，

作者为了进一步看在人的组织中会是怎么样的，做了三个人的结直肠癌的样本的实验。

结直肠癌的组织样本离体培养，用重组的人TGFbeta1来处理，同时加或者不加阻断TGFbeta1的抗体，随后不同条件下培养的样本被拿来做单细胞测序。

在三对样本中，比较有和没有阻断抗体的细胞簇的表达改变。可以看到在CAF细胞簇中有明显的变化。也就是CAF细胞簇都处在差异图的右上方。也就是说一方面CAF的TGF beta受体表达明显增多，另一方面表达发生改变的基因数也多

实验内容的第七部分，TGFβ阻断增强T细胞浸润和激活

抗体阻断后，CAF的格局发生了重塑，作者想研究肿瘤中免疫应答的影响。

作者对FFPE样本做针对CD8的免疫染色。可以看到，受抗体阻断的样本中CD8的染色斑点明显多于对照组的样本。

这是用流式细胞仪对两组样本检测CD8+ T细胞的数量，

可以明显地看到受抗体阻断的这一组，CD8+ 的T细胞数量更多

这是对两组样本，进行大量测序得到的结果，每一个列是一只小鼠的样本。

可以明显看到，这些与免疫相关的通路，都是有抗体阻断的这一组的表达更高。

作者继续做了两组样本的空间转录组，

很明显，受抗体阻断的这个样本中，T细胞浸润的点明显多，

有T细胞活性的也点也明显多

实验内容的第八部分，TGFβ阻断可增强PD1免疫疗法在体内的功效

前面的实验结果说明，TGF beta阻断可以塑造肿瘤中的成纤维细胞状况，释放CAF中的干扰素信号，并且能增强细胞毒性T细胞的浸润和活化。由于预计这些变化会促进产生有效的抗肿瘤免疫反应，所以，作者测试了抗TGF beta抗体是否可能与检查点阻断免疫治疗进行协同治疗。

作者就用抗TGFβ的抗体与抗PD1的抗体对4T1肿瘤进行协同治疗。

上面A图是接种肿瘤与注射抗体的时间顺序图，

下面B图，是用抗体的组合治疗后，肿瘤的体积大小变化。

可以看到，两种抗体联合治疗后，肿瘤的体积增大是最慢的。

从治疗终点，肿瘤体积的大小来看，

灰色的点是对照组的肿瘤体积大小，

单纯用抗TGF beta的抗体，也就是绿色的点，肿瘤体积比对照组略小。

单纯用抗PD1的抗体，也就是紫色的点，肿瘤体积并没有比对照组小，

而用联合抗体，肿瘤体积是最小的。

这是4种抗体排列组合，治疗后，单细胞测序得到的亚细胞簇的变化。

最左边，是对照组的结果

可以看到，单纯用抗TGF beta抗体，或单纯用抗PD1抗体，亚细胞簇的基因表达变化都不大

而两种抗体的联合治疗，引起了亚细胞簇基因表达的很大的变化。

接下来，作者用联合抗体来治疗MC38肿瘤，MC38肿瘤是一种炎症反应强的肿瘤。

可以看到很明显，两种抗体分别治疗，有一定的治疗效果

两种抗体联合治疗的结果，显示出很强的治疗效果。

前面抗体治疗的被种了MC38肿瘤的小鼠，有部分是没有长肿瘤的。

作者把这些没有长肿瘤的小鼠，在第一次接种肿瘤细胞后的第50天，再次接种MC38肿瘤细胞，看小鼠身上是否长出肿瘤。

H图是随着时间，看小鼠长没长肿瘤的图。

之前没有用抗体治疗过的小鼠，很快都长了肿瘤；

用单纯抗PD1抗体治疗的，大约一半小鼠长了肿瘤；

用两种抗体联合治疗的，只有约三分之一的小鼠长了肿瘤。

这个实验结果说明，用两种抗体联合治疗的小鼠，有了更好的对MC38肿瘤的免疫记忆。