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互动问答|单细胞测序技术网络研讨会问题解答
发布日期：2021-02-04浏览：
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1月28日，由dafabet黄金手机版学院主办的“单细胞测序技术网络研讨会”取得了圆满成功，直播拥有1275人次的播放量。
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在直播过程中，有许多老师提出了自己的问题，由于时间问题，没能一一为大家解答。小编选取了一些问题整理了答案，在这里分享给大家。
10x 单细胞ATAC+基因表达的联合解决方案
Q1
Spacer序列捕获DNA的原理是什么？
A1
在Tn5转座酶对染色质开放区进行切割后，会对切割下来的DNA片段两端自动加上nextra接头序列R1和R2，其中R1接头序列与Spacer序列互补，因此标签序列可以通过Spacer序列捕获Tn5转座酶切割下来的DNA片段。
Q2
染色质开放程度是怎么定量的？能测到该区域的DNA不就说明开放吗？为什么还有开放程度呢？
A2
染色质开放程度根据Peak高矮定量。每个细胞的染色质开放区的DNA会被切割下来并比对到参考基因组上，不同细胞的DNA片段会在基因组上不同区域富集形成Peak，Peak越高，DNA片段越多，在该染色体区域开放的细胞就越多，染色体开放程度越大。因此染色体某个区域的开放程度大小与该区域开放的细胞多少有关。
Q3
转录组开放程度是怎么定量的？
A3
转录组没有开放程度一说，只有染色体会开放，开放程度说明如上所述。
Q4
这个技术捕获的是细胞核的mRNA吗？那能检测到的基因是不是比较少？
A4
scATAC+RNAseq捕获的是细胞核的mRNA，检测到的基因数在PPT上有介绍，实验证明与scRNAseq整个细胞中检出的基因数相差不大。
Q5
单细胞转录组和atac是两种不同的方法？
A5
scATAC+RNAseq对细胞核中的DNA片段和mRNA是同一种捕获方式，不同的建库方法，不同的测序方式，不同的分析方法，最终可通过barcode对DNA数据和RNA数据进行整合，实现多组学分析。scATAC+RNAseq是一种产品，而单独的scATACseq和scRNAseq是两种不同的产品。
Q6
组织样本特别小，每个样本只能获得3000-5000个细胞，能否做单细胞测序，对结果的分析有何影响？
A6
如果为个体异质性比较小的小鼠、大鼠等模式动物，可以同批的同种组织混在一起制备单细胞悬液，如果为个体异质性较大的人，不推荐做单细胞测序，结果获得的细胞数和基因数都会很少，细胞聚类不准确，无法阐明生物学意义。
Q7
线粒体DNA会不会对ATAC数据造成干扰？
A7
线粒体DNA存在于线粒体基质中，而scATAC+RNAseq只捕获细胞核，理论上线粒体DNA不会存在，但实验中可能会残留一些活细胞，可能会有少量线粒体DNA污染，若严格按照规范操作，最终线粒体DNA比例小于2%。
Q8
scATAC+RNAseq是如何call cell的？
A8
1.统计每个细胞核的Fragments数和UMI数
Q9
目标基因的调控peak分析，正相关还是负相关，和目标基因表达量是前后推断关系还是相互论证关系？
A9
scATAC+RNAseq先同时得到了染色质开放信息和基因表达信息，然后再判断二者为正相关还是负相关，从而判断有哪些染色体区域开放会促进基因表达，哪些染色体区域开放会抑制基因表达。
Q10
脂肪细胞可以提核做吗？另外肌肉细胞属于多核细胞，结果与单细胞转录组有差异吗？
A10
脂肪细胞和肌肉细胞我们并没有提核的相关经验，如果有需要我们可以参考10x官方的鼠脑提核protocol和相关文献提核，如果客户有经验也可以自己提。但对于多核细胞无法做scATAC+RNAseq分析，因为提核后无法将多个核归到一个细胞中，因此无法区分细胞。
Q11
联合分析的优势在哪里？
A11
1.通过barcode信息对转录组和ATAC的数据整合使结果更加准确可靠
流感感染中旺盛的成纤维细胞活性
通过ADAMTS4损害肺功能
A
请问，共培养模型里，病毒是否可以透过培养板基质直接感染成纤维细胞？
B
有这种可能性。病毒很小，是有可以透过培养板上的微孔，漏到外层，直接感染成纤维细胞的。
A
请问，这篇文章中用老鼠模型做单细胞测序时，它是如何鉴别出来流感病毒基因的？
B
在做单细胞测序时，是把所有的mRNA都进行测序，包括可能存在的病毒的mRNA。病毒的mRNA带有病毒特有的基因序列。通过分析测到的mRNA的基因序列，可以看出有或没有有流感病毒的基因序列，如果某个细胞的mRNA序列中有流感病毒的基因序列，就可以知道这个细胞被流感病毒感染了。
A
请问，作者在整合其他已发表单细胞数据时是怎样去除批次效应的？
B
文章本身没有专门提用哪个算法去除批次效应。但文章中提到了用Seurat算法，Seurat算法中包含了去除批次效应的功能。另外，Seurat算法也是最常用的去除批效应的算法。
A
如果研制出了针对ADAMTS4的化学药物，这个化学药物会不会对当下的新冠病毒有用？
B
如果研制出了针对ADAMTS4的化学药物，有可能会对新冠病毒有用。目前新冠病毒对人体最大的伤害是引起细胞因子风暴，而不全是ADAMTS4引起的对蛋白聚糖的降解，所以拮抗ADAMTS4的化学药物不一定会对新完病毒有效。
A
如果想要检测出病毒的基因，首先它得有polyA尾巴才能被10x捕获，对这个病毒不了解，不知道是否可行？
B
病毒的基因，要在人体中得到表达、并变成蛋白，是要借用人细胞的转录翻译系统的，所以转录出来的mRNA是会有polyA尾巴的。
A
看到在流感引起的肺炎中，白介素6起到很强的作用，那是否可以通过阻断白介素6，来减少对机体的免疫伤害？
B
已有文献报道，阻断白介素6的抗体药物—托珠单抗—对新冠病毒有治疗作用。但目前，我还没有看到对阻断白介素6的抗体药物治疗流感的效果的文章报道，所以，我只能说这种可能性是存在的，但实际效果要看实验的效果。
A
这一结论可否借鉴到COVID-19？
B
“过度活化的ADAMTS4活性，会伤害肺功能” 这一结论，目前只看到在流感病毒中的报道。因为各种病毒引起肺伤害的方式是不一样的，所以不一定能借鉴到新冠肺炎。但最后要用实验来验证，才能知道是否真的可以在新冠肺炎中得出同样结论。
2.使用Ordmag算法分别计算Fragments数和UMI数的阈值，阈值以上的也就是同时有足量的Fragments数和UMI数的细胞被定义为真实细胞，阈值以下为背景。
3.使用K-means算法将表达量较低的已被判定为背景的细胞重新归入真实细胞。
2.能将特定基因的染色质开放特征与不同细胞类型的表达特征相关联
3.将细胞的基因表达特征与TF调控等表观信息联合起来实现多组学分析
