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文章概要

 

 

 

文章的题目，是《Exuberant fibroblast activity compromises lung function via ADAMTS4》。这篇文章发表在Nature杂志的2020年10月刊上。

文章的题目，翻译成中文，意思是《旺盛的成纤维细胞活性通过ADAMTS4损害肺功能》

文章的通讯作者，是Paul G. Thomas，他是美国田纳西州孟菲斯市，圣裘德儿童研究医院，免疫科的研究人员

实验内容的第一部分，对流感感染的基质反应

实验流程是把小鼠感染甲型流感病毒，在感染的第0天、第1天、第3天和第6天，

取出肺组织细胞，解离成单细胞后，

用流式细胞仪分离出不表达CD45的细胞

把得到的细胞，用10X genomics的方法做单细胞测序文库，再高通量测序。

这是不表达CD45的肺细胞的t-SNE图。

图中包含了大约40800个单细胞。

测序结果发现，流感病毒的RNA在一型肺细胞中是最多的，

其次在炎性二型肺细胞，和纤毛上皮细胞中也有较高的表达。

按基因表达，分出三个主要功能类型的细胞。

分别是：细胞外基质合成细胞，也就是extracellular matrix synthesiz, ECM合成细胞，静止细胞，和炎性成纤维细胞。

ECM合成细胞富含ECM结构蛋白基因的RNA，但是缺少代表免疫的RNA。

在炎性成纤维细胞中，作者还确定了两种不同的激活状态：损伤反应性成纤维细胞（DRFibs）和干扰素反应性成纤维细胞（IRFibs）

静止细胞既缺少炎性的RNA，也缺少合成细胞外基质的RNA。

接下来，还会反复提到DRFibs细胞，也就是损伤反应性成纤维细胞，后面我们将称之为D细胞，以方便讲解。

同样，IRFibs细胞，也就是干扰素反应性成纤维细胞，后面我们将称其为I细胞。

炎性成纤维细胞高水平地表达炎症相关基因。

如：1型干扰素，白介素6，和NF-kappa beta信号

在炎性成纤维细胞中，D细胞和I细胞，各自有不同的关键高表达基因。

D细胞的表达，更加集中在组织损伤响应方面，包括NF-kappa beta信号通路，和缺氧

而I细胞更加集中在1型干扰素响应通路中

前面是小鼠样本的分析结果。作者又用5个人类的肺活检样本做实验，得到相似的结果。

左图是对有表达胶原蛋白alpha第二个亚基因蛋白的细胞做的t-SNE图，同样分出了D细胞簇和I细胞簇。

右图，显示了这两种状态的细胞表达的基因热图。

作者在小鼠和人的肺细胞中，确认富集的表面marker蛋白，

DRFib的特征是有高表达Itga5，并且低表达Cd9；

而IRFib的特征是高表达Bst2和Cd9

这是在小鼠中，D细胞在小鼠受感染后的细胞数量变化，它在第12天时数量达到最高。

可以看到在第12天时，高表达ITGA5，并低表达CD9的细胞比在第0天时升高了许多。

这是在小鼠中，I细胞在小鼠受感染后的细胞数量变化，I细胞在第3天时数量达到最高。

可以看到在第12天，高表达BST2、并高表达CD9的细胞数量明显增加

这是呼吸衰竭而死亡的捐献者的样本，对比健康的人的样本的结果。

可以看到死亡的捐献者的肺中，具有损伤反应特性，也就是ITGA5高，而CD9低的细胞数量多。

而在健康者的样本中，很少这样的细胞。

实验内容的第二部分，调节成纤维细胞活化

接下来，作者想搞清楚，上游的刺激如何调节成纤维细胞的状态，作者设计了共培养实验。

共培养实验的装置如图所示，内层培养的是人的上皮细胞，

外层，培养的是响应成纤维细胞。

内层和外层之间的培养基是连通的。也就是说，内层的上皮细胞被病毒刺激之后，释放出来的各种调节因子，会先扩散到培养基中，再刺激到外层的成纤维细胞。

作者用人的季节性流感病毒、和禽流感病毒分别感染内层上皮细胞，看外层响应性成纤维细胞的变化，

在共培养的上皮细胞分别在若干个病毒刺激后，成纤维细胞中表达增加的基因包括：

细胞因子，如白介素6，

和几个基质蛋白酶，A基因、MMP3和MMP13.

这是成纤维细胞被单独培养，并且被细胞因子刺激后的结果。

可以看到成纤维细胞对白介素1和TNF的刺激的反应是最强的，

并且成纤维细胞中与ECM相关的基因在被刺激后高表达

作者又拿患者的鼻洗液成纤维细胞进行共培养，鼻洗液中是含有免疫细胞的。

鼻洗液和上皮细胞都表达高水平的IL1A、IL1B和TNF，这表明它们可能向成纤维细胞提供免疫信号以调节ECM相关基因的表达。

实验内容的第三部分，活化成纤维细胞中的ECM蛋白酶

这是小鼠被感染后不同天数的肺匀浆中的基因表达情况.

横座标是感染后的天数，纵座标是各个基因，颜色表示基因的表达量

可以看到，其中A基因是在感染后，最先被诱导表达的，并且A基因的表达持续整个修复期。

基于对单细胞表达的分析，发现表达A基因的细胞，限于非免疫的基质细胞

这张图，是各种细胞在感染前，和感染后A基因的表达。

可以看到在感染前，A基因只在成纤维细胞和内皮细胞中表达。

CD45阴性的细胞，是包含了成纤维细胞和内皮细胞的，所以也会有A基因的表达

感染后，A基因的表达只在成纤维细胞中显著上调

这是作者为了看A基因在人类肺病中的表达情况，找了别的科学家做的一共7个肺病的单细胞测序数据集做分析。

这7个肺病包括是：肺纤维化，间质性肺病，过敏和哮喘，新冠肺炎。

另外，作者还加入了一个类风湿关节炎的数据集。因为类风湿关节炎是一个炎性成纤维细胞驱动的疾病，放在这里做参照。

这样一共是8个数据集

这是分析8个数据集的单细胞得到的UMAP图，其中A基因阳性的细胞包括间充质细胞和内皮细胞，以及少量的上皮细胞和免疫细胞

高表达A基因的成纤维细胞，表现出活化的表型。

同时，高表达与D细胞相关的基因。

对Haberman等人的一项研究的数据进行分析，表明与健康组织相比，在炎性肺疾病中A基因表达增加。

在单个细胞的A基因表达水平上，表达水平最高的是间充质细胞，而且间充质细胞的表达水平比包括内皮细胞在内的细胞高出至少一个数量级

上皮细胞和免疫细胞中的每个细胞的A基因表达处在较低的水平，而且与对照组织相比较，表达水平没有升高。

为了确定成纤维细胞的反应在空间上是如何组织的，作者对小鼠做了呼吸窘迫高峰期，也就是小鼠感染后第10天的肺切片的空间转录组研究。

无监督的聚类分析，确定了与间质性炎症区域重叠的肺区域，也就是图中编号为0的红色的这些点。

与D细胞表达相关的基因，包括Itga5、Lox和A基因的，就集中在这个区域高表达。

其中，A基因的表达局限于肺泡附近的间质性炎症区域。

而D细胞在编号为1、2、3的区域表达变少。其中，编号为1的黄颜色区域是肺泡实质区域，编号为2的绿色区域是支气管区域，编号为3的蓝绿色区域是密集的淋巴样浸润区域

实验内容的第四部分，A基因促进致命的免疫病理反应

为了确定A基因在感染中起到的作用，及其后果，作者做了敲除A基因的小鼠模型。

用致死剂量的甲型流感病毒来同时感染敲除了A基因的小鼠，和野生型的小鼠，

结果发现，基因敲除的小鼠，也就是蓝色的这条折线有明显更高的生存率，而且P值等于0.01.

而基因敲除小鼠与野生小鼠的受感染程度没有明显差异。

图中是两类小鼠感染后的肺的情况，红线勾出的是被感染的区域

右边是定量计算被感染区域的面积，可以看到基因敲除小鼠与野生小鼠的肺部受感染面积并没有明显差异。

这是两组小鼠的动脉血氧饱合度的图，

基因敲除小鼠，也就是蓝色的点，在感染后6天，动脉血氧饱和度明显高于野生小鼠

这是感染后第9天，没感染的小鼠、基因敲除小鼠、和野生小鼠的肺切片染色图。

可以看到，基因敲除小鼠相对于野生小鼠，

显示出更少的免疫细胞浸润、更少的肺泡炎症、和更少的肺组织损伤

A蛋白是一种蛋白酶，它的底物是versican，versican翻译成中文，应该是“蛋白聚糖”的意思。我在网上查了，没有找到现成的中文翻译，我们这里还称之为versican.

Versican是一种蛋白多糖的聚合物，它是一个网状的基质，一种松散的细胞外的网络，可以指导细胞的迁移、增殖、和分化。

VCAN是versican core protein的缩写，这个基因是编码versican核心蛋白的基因。

作者检测了感染后小鼠肺组织中的vcan蛋白，

可以看到基因敲除的小鼠中，vcan蛋白更多，

而野生型的小鼠肺组织中vcan蛋白更少。

基因敲除小鼠中，产生γ干扰素的CD8+ T细胞，比野生的少

CD8+ T细胞是感染流感病毒后免疫病理学的主要推动力之一，作者测量了小鼠感染第9天时的CD8+ T细胞，

PB1是指MHC复合物中含的聚合酶基础蛋白1的肽段，Pa是指聚合酶酸性蛋白的肽段，NP是指核蛋白的肽段。

我们可以看到，含这三种肽段的MHC复合物的占比，基因敲除小鼠和野生小鼠是相似的。

这表明基因敲除小鼠和野生小鼠对甲型流感病毒有相似的T细胞应答。

作者发现，基因敲除小鼠中T细胞数量少于野生小鼠。

而组织中有高度完整的versican的地方，没有T细胞。

切片图中，有红色vcan的地方，没有绿色的CD3

接着，作者做了CD8+ T细胞的迁移情况的实验，看在有和没有VCAN包被的情况下CD8+ T细胞的迁移。

装置里层是活化的CD8+ T细胞，外层是成纤维细胞。膜上选择性包被或不包被VCAN蛋白

在有足够的表达A蛋白的成纤维细胞存在时，

如果膜上没有VCAN包被，基因敲除和野生型的CD8+ T细胞迁移是相同的，

而当有了VCAN包被之后，基因敲除的CD8+ T细胞迁移速度慢了40%。

再用不同的成纤维细胞，来看T细胞的迁移速度。

可以看到，在有静止成纤维细胞和I细胞时，T细胞迁移受到阻碍。

相比之下，D细胞让T细胞能更好地跨过versican障碍。

这与D细胞是A蛋白的主要生产者，而A蛋白会降解versican是一致的

第五部分，是用人类的真实病例的统计，来看A蛋白含量与流感病情严重程度关系

这是美国的84例小儿重症监护流感的分析，这里VFD，是ventilator-free day的缩写，中文意思是可以有多少天不用呼吸机，不用戴呼吸机的天数越少，病情越严重，这里是取VFD小于10天。

检测气管内抽吸液中的A蛋白的含量

这里1+A蛋白的log10指数大于1，对应的odds ratio是2.95，也就是A蛋白升高，VFD小于10天的概率升高到2.95倍。也就是A蛋白含量越高，病情严重的概率越高。

还是这84个病例，作者取了三个指标做分析，这三个指标分别是：

PrAHRF，长时间急性低氧性呼吸衰竭或死亡，prolonged acute hypoxic respiratory failure or death

PrMODS,长时间多器官功能障碍综合征或死亡，prolonged multiple organ dysfunction syndrome or death

还有前面说到过的VFD小于10

这三个指标阳性的病列，也就是图中红色的这些点，它们的A蛋白含量的log值，都明显高于阴性的样本。

也就是病情严重的样本，A蛋白的含量明显高，病情轻的样本，A蛋白的含量明显低。

作者把前面A蛋白含量与病情严重程度正相关的结论，从儿童推广到成人年，看这个结论是否还成立。

这是取自中国广东和台湾的67例成人的样本。

还是看刚才那三个指标，很明显阳性样本的A蛋白含量高的, odds ratio都在2以上，也就是病情严重的概率高2倍以上。

为了看A蛋白浓度是否可以预测病情发展，作者取那些成年人患病早期的气管内抽取液样本，测里面的A蛋白浓度，再比照后面实际情况中，VFD小于10这个指标，

结果发现odds ratio是1.95，P值是0.02。也就是A蛋白含量高的病例，后面病情变得严重的概率会升高到1.95倍，并且统计上有显著性差异。