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《单细胞测序分析肥胖对肿瘤微环境代谢的影响和抑制抗肿瘤免疫力》上周在dafabet黄金手机版学院开播，没来得及观看直播的小伙伴可以扫描下方二维码观看回放！

小编把陈巍老师的直播课程以图文形式整理出来啦，跟小编一起来看看吧！

文章概要

文章的题目，是《Obesity Shapes Metabolism in the Tumor Microenvironment to Suppress Anti-Tumor Immunity》。这篇文章发表在刊上。

文章的题目，翻译成中文，意思是《肥胖会影响肿瘤微环境中的代谢，从而抑制抗肿瘤免疫力》

文章的通讯作者，是Marcia C. Haigis，她是哈佛医学院，细胞生物学系的教授

研究背景

实验结果分析

实验内容的第一部分，HFD以CD8+ T细胞依赖性方式加速MC38肿瘤的生长

作者先建立HFD小鼠模型，就是同样的小鼠分两组，

一组对食物不加限制，小鼠想吃多少就可以吃多少，并且是高脂肪食物，也就是high-fat diet，首字母缩写是HFD，在图中是用绿颜色来表示；

另一组是对照组，对照组的小鼠的进食有限制，也就是control diet，首字母缩写是CD，在图中用棕色的来表示。

给予不同的饮食8到10周之后，可以看到HFD组的小鼠体重明显高于CD组，也就是绿色的实验组明显更加肥胖，棕色的对照组相对瘦。

这里，WT是野生型小鼠，TCR alpha KO是敲除了T细胞受体alpha亚基的小鼠，后面会细说

HFD小鼠表现出高胆固醇、和轻度高血糖等特征

小鼠被注入MC38大肠腺癌细胞，MC38是一种免疫原性很强的肿瘤。

可以看到在HFD小鼠体内，MC38种瘤细胞的生长明显快于在对照组中的生长速度。

为进一步研究不同免疫原性肿瘤，在肥胖或正常小鼠中会各自发生什么情况，作者在肥胖与正常小鼠身上分别种了免疫原性为高、中、低的三种肿瘤。

可以看到，免疫原性最高的E0771乳腺癌接种后，在HFD小鼠和正常小鼠体内的差异是最明显的。

免疫原性中等的B16黑色素瘤接种后，在HFD小鼠和正常小鼠体内的差异也较明显，但不及E0771肿瘤那么明显。

免疫原性最低的Lewis肺肉瘤，在HFD小鼠和正常小鼠体内的差异不明显。

为了看免疫原性对肿瘤生长的影响，作者还把有中等免疫原性的B16肿瘤细胞做了基因改造，改造后的B16细胞能表达典型的免疫原卵清蛋白，也就是ovalbumin。

再用这个表达卵清蛋白的肿瘤细胞接种到小鼠身上，结果，在HFD小鼠和正常小鼠身上，看出了很明显的生长情况的差异，肿瘤在HFD小鼠身上生得明显更大。

作者为了搞清，肿瘤的生长差异，是不是因为受到T细胞的控制，在敲除了T细胞受体的α亚基基因的小鼠身上做实验。

结果如图所示，敲掉了TCRα亚基基因之后，MC38肿瘤在HFD小鼠和对照组小鼠身上的生长速度变得没有明显差异。

这里，右图是去掉了CD8基因的小鼠，MC38肿瘤生长的结果，可以看到，肿瘤在HFD小鼠和对照组中，生长的速度没有明显的差异。

而在同型的野生型小鼠中，肿瘤在HFD小鼠中生长更快，而在CD组中生长得要慢许多。

实验内容的第二部分，HFD喂养减少了肿瘤内CD8+ T细胞的数量和功能

在MC38肿瘤种到小鼠身上10到14天的时候，这时候HFD和CD两组小鼠身上的肿瘤体积还比较相似，这时候，用流式细胞仪来分析肿瘤中的CD8+ T细胞，发现：

HFD小鼠身上CD8+ T细胞要明显少于CD小鼠，而CD8+ T细胞是CD45+白细胞浸润的一部分。

而同时，脾脏、和引流淋巴结中，CD8+ T细胞的数量并没有明显减少

为了搞清免疫T细胞相对于肿瘤细胞的数量，作者用转基因的、表达带有GFP荧光蛋白的MC38细胞来接种到小鼠身上。

结果看到，HFD小鼠中CD45+ T细胞相对于肿瘤细胞数，有下降。

HFD小鼠中CD8+ T细胞相对于肿瘤细胞数有更加明显的下降。

Treg细胞，也就是“调节性T细胞”，它的标志基因是CD4和FoxP3

作者检测了肿瘤中CD4+ T细胞的数量与肿瘤细胞的数量的比例，发现在HFD小鼠中这个比例下降程度没有CD8+ T细胞下降那么多。

而CD4+ T细胞中FoxP3+的细胞比例没有改变

结果就是：在肿瘤中CD8+ T细胞的相比于Treg细胞的比例，是明显下降的。

作者还看了MC38肿瘤中其它免疫细胞群体的影响。

自然杀伤细胞，也就是NK细胞，在引流淋巴结和肿瘤中，数量是差不多的

CD11b+ 髓样细胞在HFD中的比例有上升

对应于GR1+ CD11b+ 髓样抑制细胞的增加，和F4/80+ GR1 CD11b+肿瘤相关巨噬细胞的增加，肿瘤相关巨噬细胞也就是TAM细胞

而髓样抑制细胞，和TAM细胞，是两种已知的促进肿瘤生长的细胞群

基于Ki67+的水平，可以知道来自HFD小鼠的CD8 +肿瘤浸润淋巴细胞的增殖较少，肿瘤浸润淋巴细胞，也就是tumor-infiltrating lymphocytes，首字母缩写是TIL

较小比例的HFD CD8+肿瘤浸润淋巴细胞表达共刺激受体ICOS

在HFD小鼠肿瘤中表达PD-1的CD8+ TIL更少

实验内容的第三部分，单细胞RNA序列显示肿瘤浸润的免疫细胞群中饮食诱导的变化

接下来，作者对CD和HFD两组小鼠的MC38肿瘤样本中CD45+的白细胞，做单细胞RNA-seq。

这是测序后，经过无监督的聚类得到的16个细胞簇。每个簇都包含来自CD和HFD两组小鼠的细胞。

接着，按通常已知的促癌、或者抑癌遗传标志基因来标注这些簇

比较HFD和CD两组小鼠身上浸润肿瘤的白细胞中，淋巴细胞明显减少

对白细胞做KEGG代谢通路的富集。

可以看到，CD小鼠肿瘤中，KEGG通路主要富集在糖的代谢通路上，包括：果糖、甘露糖，糖酵解、糖异生，半乳糖代谢，和磷酸肌醇代谢，还有氧化还原通路。

相对，HFD小鼠肿瘤中，KEGG通路主要富集在脂肪和胆固醇的代谢通路上，(包括：糖鞘脂的生物合成，类固醇的生物合成，脂肪酸代谢和TCA循环),叶酸生物合成，戊糖和葡萄糖醛酸酯相互转化

这是，HFD相比于CD，在糖代谢和脂肪代谢上的比较。

左上角是与HFD相关联的，右下角是与CD相关联的。

可以看到与糖代谢相关的这些通路，在HFD细胞中，都相对于CD细胞是下降的。

而与脂肪代谢相关的这些通路，在HFD细胞中，都相对于CD细胞是上升的

从CD8+ 细胞的受体特征，做KEGG分析，可以看到HFD小鼠中，脂肪酸代谢的这个通路是特别突出的。

实验内容的第四部分，HFD重塑了TME中的肿瘤免疫状况

作者用反复多重免疫荧光方法，来看FFPD样本中的蛋白表达。

这里，右边的几幅图是单一蛋白发出的荧光，最左边的是合并之后得到的图像

通过荧光，可以直接地看到HFD小鼠的肿瘤中所含的CD8+ T细胞更少，

并且，T细胞不集中在肿瘤的边缘位置

参与糖代谢的酶，在肿瘤组织中的分布不均匀。

如图所示，

这是GLUT1，也就是葡萄糖转运酶1

LDH，也就是L型乳酸脱氢酶

和PKM2，也就是丙酮酸激酶同工酶M2，这三个酶在肿瘤的空间分布的情况

为了搞清楚GLUT1表达量与CD8+ T细胞的空间分布的关系，作者先对这两者做FFPE样本的空间染色。

图中，紫色的是GLUT1，绿色的点是CD8.

我们可以得到一个初步的印象，就是CD8大多分布在黑色的区域，也就是没有GLUT1的区域。

为了进一步精确计算GLUT1和CD8+ T细胞的关系，作者先用算法摸拟，看算法估计在各处出现CD8+ T细胞的可能性。

图中橙色的点，是应该包含CD8+ T细胞的，蓝色的点是应该排除CD8+ T细胞的

右边图中，是摸拟情况与实测情况的对比图，一致性太好了。

再进一步看饮食对GLUT1高的地方，免疫细胞的影响。

分析结果表明在HFD小鼠中，在GLUT1高的地方，CD8+和CD4+T细胞都减少。

实验内容的第五部分，HFD导致CD8+ T细胞与肿瘤细胞发生相反的代谢变化

对dLN(淋巴引流液)和TIL(肿瘤浸泣淋巴细胞)做主成份分析，发现第一主成份很鲁棒地把dLN和TIL清楚地分开。

第二主成份则把来自CD小鼠，还是HFD小鼠分得很清楚。

因此，主成份分析显示，饮食对肿瘤中CD8 + T细胞转录谱的影响要大于dLNs，这表明肥胖的CD8 + T细胞的差异是TME特有的

作者为了了解CD8 + T细胞中TME特异性的适应性反应，研究了CD8 + TILs中的转录变化，只有四个基因显示出显著性变化。

就是图中标出的这4个彩色的基因，而在这4个彩色的基因中，有三个是与胆固醇合成有关的。分别是：ELOVL6，DGAT1和LDLRAP1

MC38的肿瘤在CD与HFD小鼠中，有32个基因的表达有显著差异，

基因富集显示，CD小鼠的肿瘤中，富集了缺氧与炎症相关基因

作者进一步分析了CD和HFD的肿瘤中代谢基因的表达差异，

发现有两个基因在CD小鼠中的表达明显高于在HFD小鼠，分别是Phd3和Nmnat2这两个基因。

其中，Phd3是Proly-hydroxylase 3的缩写，中文名是脯氨酰羟化酶3。它最著名的功能是通过羟化转录因子HIF1a来调节对缺氧的反应

实验内容的第六部分，HFD重新编程TME中的脂肪利用

为了监控肿瘤细胞和CD8+ 肿瘤浸润淋巴细胞中的脂肪储存情况，作者用LipidTOX方法对CD和HFD中的肿瘤浸润淋巴细胞做分析，发现其中的脂肪储存量是差不多的。

再看两者肿瘤细胞的脂肪储存量，也是差不多的。

作者进一步用C16-BODIPY检测细胞对脂肪酸的摄取。

HFD小鼠中的肿瘤细胞相比于CD小鼠的摄取更多的脂肪酸

进一步检测，发现在HFD小鼠的肿瘤中的CD8+的T细胞，摄取的脂肪酸，相比于CD小鼠的要少。这可能是受了肿瘤细胞抢到更多脂肪酸的影响。

而同时，引流淋巴结中，两者的脂肪酸摄取量是相似的。

在B16-OVA-REP肿瘤中，得出同样结果。

HFD小鼠中的肿瘤摄取更多的脂肪酸，而HFD小鼠中CD8+ T细胞摄取的脂肪酸比CD小鼠的少。

再在E0771肿瘤中也得到相同的结果。

由此，作者认为，是肿瘤细胞抢掉了更多的脂肪酸，导致CD8+ T细胞得到的脂肪酸变少，进而让CD8+ T细胞变少。

作者为了验证自己的想法，用活性炭吸附过的培养基来培养CD8+ T细胞。之所以用活性炭来吸附一下培养基，是为了去掉培养基中现有的脂肪酸。

再在这个培养基中定量地加入脂肪酸，看CD8+ T细胞的生长情况。

实验结果表明，加入脂肪酸后，CD8+ T细胞生长更好。

这辅证了作者前面的想法，肿瘤中CD8+ T细胞少，可能是因为肿瘤细胞抢掉了更多的脂肪酸。

实验内容的第七部分，蛋白质组学分析揭示了HFD肿瘤细胞对脂肪酸的摄取和氧化特征

接下来，作者对样本做蛋白质谱分析。

分析的过程如图所示，先是在小鼠身上种有GFP荧光基因改造的MC38肿瘤细胞，12天后，把肿瘤组织切下来，进行组织解离，再做细胞分选。

得到有GFP荧光，但没有CD45蛋白的细胞，

做蛋白抽提和胰酶消化。

再做串联质谱分析。

这是对蛋白质分析结果做基因富集分析得到的结果。

发现脂肪酸代谢和氧化磷酸化在HFD的肿瘤样本中富集。

干扰素gamma响应在CD小鼠的样本中富集，这可能是因为HFD中CD8+ T细胞减少的缘故。

分析表明，HFD支持肿瘤的脂肪使用，主要是通过提高转运蛋白SLC27A1和脂肪结合蛋白FABP5，以及提高线粒体中参与beta氧化的蛋白如CPT1A、ACSM3等来实现。

相反，糖酵解中的不可逆步骤，或者限速步骤，在HFD中是被下调的。

这是HFD中，能量代谢的调节图。

红色部分是被上调的，蓝色部分是被下调的。

总之，蛋白组学数据支持HFD MC38肿瘤细胞重新控制新陈代谢以增加脂肪酸摄取和氧化。

实验内容的第八部分，HFD改变TME的中性脂质成分

这是在肿瘤细胞、血浆、和肿瘤质间液中各种脂质的含量比较，

从图中可看出这三者中的脂质含量比较结果是有差异的。

这是CD和HFD血浆和肿瘤质间液中指示的DAG和TAG脂质种类的相对丰度。

HFD的肿瘤质间液中，甘油二酸酯、和甘油三酸酯都有明显的增加

而在血浆中，没有显著变化

这说明HFD有一个脂质丰富的微环境

实验内容的第九部分，肿瘤细胞PHD3表达控制HFD TME中的脂肪酸利用率

因为发现HFD对TME重新编程，以增强肿瘤中的脂肪吸收，所以作者假设这些HFD诱导的肿瘤细胞脂肪代谢变化可能会影响TME中的游离脂肪酸的利用率和CD8+ T细胞的功能。

作者推测，预防HFD引起的代谢重排可能会恢复CD8+ T细胞反应并防止HFD上的肿瘤生长增加。

为了验证这个想法，作者在MC38细胞过表达了PHD3基因。PHD3是Prolyl-hydroxylase 3的缩写，中文是“脯氨酰羟化酶3”，

左图是MC38肿瘤细胞被转基因后，过表达PHD3蛋白的电泳图。

右图是过表达PHD3的MC38，它在培养条件下，与原来的MC38细胞的比较，可以看到两者的生长速度是一样的。

在小鼠模型中，过表达PHD3的肿瘤的生长中，没有改变组织相容性复合物1，也就是MHC-1的表达改变

但是过表达PHD3，显著减少肿瘤细胞对脂肪酸的吸收

作者用用靶向代谢组学来测量血浆和肿瘤间质液中的游离脂肪酸

看到HFD小鼠的血浆中棕榈酸和油酸的循环水平都上升了

而HFD小鼠的肿瘤间质液中, 游离脂肪酸，相比于CD小鼠的减少

血浆中游离脂肪酸高，而肿瘤间质液中脂肪酸低，这说明HFD小鼠的肿瘤摄取脂肪酸的强度高。

在CD小鼠中，过表达PHD3，没有引起肿瘤间质液中游离脂肪酸的大的变化

而在过表达PHD3的HFD的肿瘤间质液中，几个主要的脂质碳源游离脂肪酸，包括棕榈酸酯和油酸酯升高

过表达PHD3，能恢复HFD小鼠的TME中的棕榈酸酯的可得性

因此，恢复肿瘤细胞中PHD3的表达足以改变TME中的养分利用率

实验内容的第十部分，肿瘤细胞PHD3过表达促CD8+ T细胞肿瘤控制

作者考虑，如果肿瘤微环境中，因为游离脂肪酸耗尽，而导致抗肿瘤的免疫力减少，那么抵消这种微环境中的代谢情况，就可能会增加浸润的CD8+ T细胞，并进而加强对肿瘤的抑制。

前面的实验，已经看到PHD3过表达会减少对游离脂肪酸的消耗，让微环境中的游离脂肪酸变多，那么是否过表达PHD3的MC38肿瘤会有更多的CD8+ T细胞。

作者在同一个小鼠身上，对腹部对称的两侧，一边种有过表达PHD3的MC38肿瘤细胞，另一边种有空载体的MC38肿瘤细胞。

这是肿瘤组织中CD8+荧光染色的结果

在CD小鼠中，空载体肿瘤和PHD3过表达的肿瘤中，看上去都有较多的CD8+的荧光点

而在HFD小鼠中，空载体肿瘤的CD8+荧光点明显少，而PHD3过表达的肿瘤中，CD8+的荧光点明显增多。

右边，定量计算的图，也证实了肉眼的观察

然后，看肿瘤体积的变化。

可以看到在CD小鼠中，有没有PHD3的过表达，肿瘤体积变化不大

而在HFD小鼠中，过表达PHD3的肿瘤体积明显小于没有过表达的肿瘤

这说明过表达PHD3，能够在HFD小鼠中减缓肿瘤的生长

接下来，在敲除TCR基因的小鼠中做同样的实验，我们看到4条线几乎合在一起，也就是说肿瘤生长不受PHD3影响、也不是受HFD的影响。

再进一步研究，

发现PHD3过表达的肿瘤在CD8耗尽的小鼠中无差别，

而在同型小鼠中是有差别的。

这样，综合上面几条线索，作者得出结论：HFD诱导的肿瘤局部代谢的变化，改变了脂肪酸的分配，并降低了肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫力

实验内容的第十一部分，PHD3丢失与多种人类癌症中抗肿瘤CD8+ T细胞功能降低相关

作者进一步在公开数据库中，找现成的数据，来看PHD3和肥胖的关系。

从TCGA的结肠腺癌的数据中，可以看到BMI大于等于30的患者，PHD3的表达量明显低于BMI小于30的人，而且P值小于0.05

作者进而发现在肿瘤中的PHD3表达量少于正常组织，而且P值小于万分之一

在BMI大于等于35的人的肿瘤中CD8+ T细胞浸润明显少于BMI小于35的人的肿瘤，而且P值小于0.05

作者把肿瘤病人按照PHD3的表达进行划分，再对应到免疫反应情况的冷热程度。

左端是免疫反应最冷，右端是免疫反应最热

这是PHD3表达最低的10%的样本，中间蓝条子的位置是样本免疫冷热所处的相对位置。可以看到大多数的蓝条子处在左端，也就是处在冷的免疫状态。

下面一行，是最低的前20%的样本，依然是偏向左端。

下面这个长方块，是几个重要免疫相关基因的表达水平。红色是热，蓝色是冷。

总之，我们看到PHD3表达量低的肿瘤，免疫反应也低。

这表明，在人的癌症中，PHD3表达的下降与免疫反应减弱是正相关的。

总结