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上课笔记|用单细胞功能基因组学方法分析癌症耐药性的非遗传起源
发布日期：2021-01-15浏览：
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上上周我们结束了dafabet黄金手机版学院特邀名师讲堂第十八课——《用单细胞功能基因组学方法分析癌症耐药性的非遗传起源》，没来得及看直播的小伙伴可以扫描下方二维码观看回放视频。
小编把直播课件以图文的形式整理出来啦，不想看视频回放可以继续下滑看图文。
文章概要
文章的题目，是《Profiling the Non-genetic Origins of Cancer Drug Resistance with a Single-Cell Functional Genomics Approach Using Predictive Cell Dynamics》，文章发表在Cell System杂志的2020年11月刊上
文章题目，翻译成中文，就是《使用预测性细胞动力学用单细胞功能基因组学方法分析癌症耐药性的非遗传起源》
文章的通讯作者，是Jeremie Roux，他是法国蔚蓝海岸大学，尼斯癌症和衰老研究所的研究人员
背景知识介绍
实验结果分析
作者采用了一种叫“Fate-seq”的检测体系。我们来说这个检测体系的工作原理
在这个检测体系中，先用活细胞显微镜观察用药后细胞的变化，
再用激光显微切割仪获取单个细胞，尤其是挑那些对药物很敏感的、和对药物完全不敏感的两个极端的细胞，
最后是针对单细胞做RNA-seq，再通过RNA-seq的数据分析细胞中可能引起耐药的基因表达变化
作者选用的细胞是HeLa细胞，Hela细胞先经过稀释，进行扩增培养。
扩增之后的细胞，一部分用药物进行筛选，根据对细胞表型的预判，挑出部分细胞做单细胞测序，另一部分留着做对照。
经过药物筛选的细胞，部分死亡，部分存活，把经过筛选活下来的细胞，再进行72小时的培养，做后续观察。
这两张图，是Hela细胞经过药物处理后的结果，左图是第一次筛选的细胞，右图是筛选后的细胞，再生长72小时的结果。
左图中，横轴是药物的浓度的指数值，纵轴是活下来的细胞的百分比。
图中有四条线，其中绿色的这条线是母代的细胞的实验结果，另外三条线，是挑的三个克隆的细胞的表现。可以看到左图的这四条线分得比较散，也就是不同的细胞之间生存率有越大的差异
右图，是经过一轮筛选后，重新生长出的细胞，挑三个克隆与母代细胞的比较，
把左右两边的图进行比较，可以看到左图中的几条线分得较开，而右图中的几条线聚得较紧，也就是说右边几个实验组得到的生存曲线结果，与母代细胞得到的结果更加接近。
再看这两个柱状图，是母细胞，和克隆细胞，以及处理后72小时的细胞的变化情况的定量结果。可以看到右图中的变化较小，与母细胞更接近。
文章中，观察细胞对TRAIL处理的响应，是通过在显微镜下观察FRET现象，来得到的。
这是显微镜下，看出来的FRET的情况。颜色越红，FRET的值越高。FRET是Fluorescence Resonance Energy Transfer的缩写，是荧光共振能量转移的意思
在这里，所用的HELA中的caspase 8基因是被基因工程改造过的，caspase 8基因被连上了荧光蛋白基因，所以可以在显微镜下通过荧光，看到caspase 8基因的表达改变。
caspase 8，是参与细胞凋亡调控的重要基因
之前的研究，已经知道，药物处理后50分钟，caspase 8的比例，是一个鲁棒的细胞命运的预测因子。
这是监控多个单细胞的caspase-8的FRET比率的结果。
我们先放大上面这半张图，
这张图里面，横轴是时间，纵轴是FRET比率。也可以理解caspase 8蛋白的表达量的改变情况
红线是死掉的细胞，蓝线是活下来的细胞。
可以看到，红线的斜率普遍比蓝线的斜率更陡，也就是说，死掉的那些细胞，它的caspase-8含量的升高速度更快。
接下来看来看图的下半部分，这半张图显示会死去的细胞，和活下来的细胞，它们FRET值随时间变化的斜率。
左边的这些是死掉的细胞，右边的这些是活下来的细胞。可以看到活下来的细胞中，有几个的斜率是特别低的，也就是下面这几个细胞，它们是被预判会活下来的，会被显微切割下来做单细胞测序。而会死掉的细胞，那几个处在最高位置的，是被预判最会死掉的细胞，也被显微切割下来做单细胞测序。
这是跟踪158个细胞的FRET变化的结果。
图中红色线，是被预判会死掉的细胞，蓝色线是被预判会活下来的细胞。
接下来，是对培养的细胞进行显微切割。
挑选的对象，就是前面提到的预判为对药物最敏感，或都药物最有抗性的细胞，进行显微切割，
分别放入单一的试管，进行逆转录，
再加上barcode，进行建库测序。
这是被预测分别是敏感和耐药的细胞的，它们的PCA图，横轴和纵轴分别是主成份一、和主成份二。
在PCA分析图中，敏感与耐药的细胞并没有明显地聚成聚落
当对信号通路进行富集，
突显“细胞生存与死亡通路”这条信号通路有明显的富集
这是各个细胞的各个基因表达的热图。
横轴上排列的是细胞，左边预计耐药的细胞，右边是预计敏感的细胞。
纵轴上排列的是基因。
有明显表达差异的基因，被用粗体字标示了出来，其中特别用箭头标了两个基因，DNM1L和SIVA1.
这里左边是比较敏感与耐药细胞的基因表达的火山图，右边是MA图。
火山图，大家已经比较熟悉了，火山图中可以看到，DNM1L这个基因在敏感细胞中的表达明显比耐药细胞中的表达少。而SIVA1这个基因在敏感细胞中的表达明显比耐药细胞中的表达多。
另外作者还标了5个基因都是在敏感细胞中高表达。
右边是MA图。MA图的特点是把变化放在纵轴上，中间零点水平线代表表达量没有变化，偏离水平线表示表达量有变化，这样设定是因为人眼对偏离水平线的东西更加敏感。另外，横轴标示的是平均的表达量。
在MA图中，DNM1L这个基因的表示变化也是很明显的。其它几个基因也有标示。
作者接下来针对这些基因，做这些基因是否影响细胞生存的功能实验
1.DNM1L基因编码DRP1蛋白，DRP1是Dynamin-1-like protein的缩写，这个蛋白是GTP酶超家族的成员之一，它介导线粒体和过氧化物酶体的分裂，并参与发育调控的细胞凋亡和程序性坏死
2.Mdivi-1是一种化合物，它的结构如右图所示，它是DRP1蛋白的选择性抑制剂
3.Dynasore是另一种化合物，它的结构如右下图所示，它也是一种DRP1蛋白的选择性抑制剂
这是Mdivi-1结合TRAIL处理细胞的效果。
左图，紫色的线是加了Mdivi-1的，灰色的线是没有加Mdivi-1的，也就是说灰色的线是对照组的线。
可以明显地看到，紫色线的斜率更加陡，灰色线的斜率相对更缓。
看右边的小提琴图，紫色的这些点，明显Caspase-8的表达水平更高。
这个柱状图，显示的是细胞的存活比率，可以看到紫色的这组细胞，存活率明显低。
这张细胞随时间变化的生存图中，可以明显地看到，紫色的这组条线明显处在灰色线的左下方。也就是说有Mdivi-1处理的细胞，活的时间更短
这一组图说明了：当有Mdivi-1存在时，接受TRAIL处理，细胞中的caspase 8的表达调高，细胞生存比率下降，细胞的生存时间变短。
这是Dynasore结合TRAIL处理细胞的结果。
左图，蓝线是TRAIL加了Dynasore的结果，绿线是单纯TRAIL的结果。
右图中，TRAIL+Dynasore的Caspase 8的表达高，而且相应的细胞存活率低。并且细胞的寿命更短。
这说明Dynasore结合TRAIL的实验，都导致了细胞的Caspase表达升高，细胞存活率下降，并且细胞存活时间更短。
接着，作者对刚才提到的几个基因，分别用基因工程方法做过表达的细胞株。
并且过表达的基因都融合了荧光蛋白mRFP1，以方便观测。
这个图就是对SIVA1基因做了转基因过表达的细胞做TRAIL实验。
这里的小提琴图中，蓝线灰点子的这群细胞是用表达单纯mFRP蛋白的细胞，桔红色线包围的桔红色的点子，是被转基因了SIVA1基因的，我们可以看到转了SIVA1基因的细胞，其中的caspase-8是高表达的。
而且桔色这组的细胞的生存率相比于对照组更低，
细胞的生存期更短。
这者说明了，SIVA1这个基因表达越高的细胞，在TRAIL实验中，caspase 8的表达更高，而且细胞生存率越低，细胞的生存时间也越短。
这是在TRAIL实验中，敏感的细胞表达更高的另外5个基因，做成带mRFP1的融合基因之后，做转基因的过表达细胞系，再做TRAIL实验。
我们可以看到，这5个基因的过表达效果，都是caspase 8表达升高，细胞的生存率变低，生存期变短。
这里，是刚才列出来的5个基因，加上SIVA1基因，一共6个基因，作暑把它们做转基因过表达后，用TRAIL处理，看细胞的克隆数量。
很明显SIVA1的影响最大，细胞克隆数减少最明显
作者画出了这6个基因与caspase 8基因的关系，用距离直接地表明了关系的远近。可以明显看到SIVA1与caspase 8的关系最近
这里，每个基因的圈的大小，是这个基因表达情况的离散程度，圈越小，则离散程度越小，圈越大则离散程度越大。
并且，用红绿两组颜色表明了关系的两个方面，这里，从橙色到红色，显示该基因关联到caspase 8活力增加。
从浅绿到深绿，是显示该基因引起细胞死亡的增加。
注意，这里，圆圈的大小与圆圈的绿色深度正相关，也就是基因表达的离散度越大，细胞的死亡越多
总结
