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文章的题目是《Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease》，文章发表在Cell杂志的2020年8月刊上

文章的题目翻译成中文，意思是《空间转录组学和原位测序研究阿尔茨海默氏病》

通讯作者，是Bart De Strooper，他是伦敦大学，英国痴呆研究所的主任

老年痴呆症的背景知识

阿尔茨海默症，英文叫Alzheimer disease，中国俗称“老年痴呆症”，是一种神经退化性疾病。在本视频中，接下来会把这个病称为“AD病”，也就是Alzheimer Disease的首字母缩写

AD病进展缓慢，病人从出现初期症状到最后死亡，往往要经过10～20年时间

这是一个患AD病的病人，这个病人生前是一名画家，这是他在发病后历年的自画像。我们可以从他的画中看出他病症的逐渐恶化

之前的研究，发现老年痴呆症的病人的大脑中，往往有纤维状类淀粉蛋白斑块沉积、和Tau蛋白沉积，并且病情的严重程度与淀粉样沉积的数量正相关

淀粉样沉淀来源于amyloid precursor protein，简称APP，APP这个蛋白被分泌到细胞膜外，并被beta分泌酶、或gamma分泌酶切断，产生Amyloid beta蛋白，多个Amyloid beta蛋白单体会聚集在一起，形成Amyloid beta蛋白聚合物，进而形成斑块状沉淀，也就是Amyloid beta plaque，又被简称为A beta斑块、或Aβ

实验结果分析

实验内容的第一节，空间转录组样本切片方法

实验中选了两种小鼠，一种是AppNL-G-F品系，这是一个有AD病的小鼠，并且该小鼠的APP基因被转基因替换成了人的APPNL-G-F基因，NL，G，F分别是APP基因上会引起AD病的三个突变

另一种是C57BL/6，是野生型的小鼠，是作为对造组的。

小鼠取样的年龄，分别是3个月、6个月、12个月、18个月。

切片的方法：

横断切片

连着三片，中间一片做空间转录组，前后各一片做免疫荧光

切片厚度是10微米

前后两片免疫荧光与中间一片空间转组的数据组合在一起，得到蛋白与RNA的空间对应关系

实验中用的是老版的空间转录组

点与点的圆心之间的距离是200微米

点的直径是100微米

这一个点所包含的范围，称为一个domain

每个domain上预先种上了逆转录的引物

引物上有对应到芯片空间位置的barcode序列信息

荧光免疫染色，显示出脑子切片的样子

在一个domain的视野中，看到包括Aβ和其它相关蛋白的染色荧光

用20个空间转录组切片，一共测到了10,327个转录组点

这10,327个点按空间位置，被分成了14个区

14个区在图中有彩色标注了出来，同时每个区也标注了对应的转录组点的数量

左图，是这一万多个转录组点的tSNE图，把图中的点按该点所在的空间位置进行颜色标示，

右边的图，是把这些转录组点，用是野生型的、还是有AD病的，以及小鼠出生的月份数进行标示。

在右图中可以看到，野生型的小鼠，12个月和18个月的点，也就是红色和紫色的点，是高度重合的，也就是说，野生小鼠的脑子，在12个月和18个月，变化是不大的。

而AD型的小鼠，12个月的点和18个月的点是分开的，也就是黄色和绿色的点，是分开的，也就是说，AD型的小鼠的脑子，在12个月和18个月之间，脑子是有较大变化的

实验内容的第二节，将基因表达改变与Aβ积累联系起来

这是对各个年龄的AD小鼠大脑的免疫荧光染色。上面一排是整体图，下面一排是局部放大的图。

图中，这个黄颜色的圈，就是对应于空间转录组的一个domain。

中间的白色荧光，是Aβ斑块被染色后发出的白光。

可以明显地看到，随着小鼠年龄的增长，脑子里白色的点越来越多，也就是Aβ斑块越来越多。

到18个月的时候，一个切片中会有1500个Aβ斑块的点。

并且，可以看到，Aβ斑块先是在小鼠脑子的背面出现，再发展到腹侧的皮质、丘脑和海马

左边B图，是对空间转录组的domain，所对应位置进行Aβ斑块的光信号进行数字化的过程。

每一个黄色的圈，就是一个空间转录组的domain，计算这domain中的每个pixel的光强，以于pixel光强是否超过阈值的，转换成二进制数值，也就是1和0.

然后，计算每个domain的Aβ index。那Aβ index值越大，也就是这个domain里的Aβ斑块的面积越大。

右边的两张图，分别是3个月和18个月的AD小鼠脑子中的Aβ index，可以明显看到，18个月的Aβ index值很高。

作者接着拿RNAscope的结果与空间转录组的结果做对比。

右边这三张彩色的图，就是RNAscope的图，它的原理是做原位RNA测序，以Aβ斑块为圆心画圆，看在一定的半径之内特定基因的RNA的表达量。

关于原位测序的相关知识，可以在网上，比如B站搜一下“陈巍翻译 原位测序”，那里面有详细的介绍。

左边的这张散点图，它的横轴是RNAscope的倍数改变的log值，纵轴是空间转录组的倍数改变的log值，图中的6个点，是6个基因的结果，可以看到RNAscope的结果与空间转录组的结果高度一致。

相关系数是0.92, P值是0.009

实验内容的第三部分，PIGs基因模块

这是对Aβ斑块附近的基因表达改变，对比基因型的表达改变，得到的图。

左边的图，是按照GO条目来分的，

可以看到，18个月的抗原处理这个条目，处在最右上角一个很显眼的位置。

而髓磷脂的这个条目，在3个月的时候，在较高的位置，而到了18个月的时候，到了下面这个位置。

右边的图，是按“权重基因共表达网络分析”得到的图。

其中purple这个点，包含了：趋化性、溶酶体降解、炎症，特别是抗原处理。这说明在18个月的AD小鼠脑中，在Aβ斑块周围，免疫相关的基因高表达。

而在三个月的时候，这些基因没有高表达。这个purple的点，包含了57个基因，作者定义这群57个基因，叫“plaque-induced genes”，缩写是PIG，意思是由Aβ斑块引起高表达的基因。

另外，这里的red这个点，对应于左图的髓磷脂的这个点。

这是PIG基因在各个年龄段的AD小鼠脑中表达的小提琴图，可以明显地看到，3个月的时候，这些基因的表达还是较低的，随着AD小鼠的年龄增长，PIG基因群的表达越来越高

PIG基因群在AD小鼠脑中各个区域的表达，3个月的时候，脑中各个区域的表达都较低，而到了18个月的时候，脑中各个区域的PIG基因表达都大幅升高

这是空间转录组每个domain中的PIG基因群表达水平与Aβindex的关系图。

横轴是Aβindex，也就是这个domain中的Aβ的免疫荧光染色得到的荧光强度。

纵轴是这个domain中PIG基因群的表达的升高程度。

可以看到，PIG基因群的表达水平，与Aβindex有正相关性，计算得到的相关系数是0.39，P值接近于0.

小胶质细胞是已知的脑子里执行免疫功能的细胞，

这里DAM是disease associated microglia基因群的缩写，也就是与疾病相关的小胶质细胞基因群的意思

ARM是activated response microglia的缩写，被激活的小胶质细胞基因群的意思，DAM和ARM都是小胶质细胞起免疫作用时会激活的基因群。

把PIG基因群与DAM/ARM基因做对比，有18个基因是重叠的。

A1基因群是星形细胞的基因，

PIG基因群与A1基因群有5个基因是共有的。

图中，把相互连接关系最紧密的10个基因用红颜色标了出来。

这是3个月和18个月PIG、Mic1基因的表达改变

紫色的点是PIG基因群中的基因，可以很明显地看到，明显地看到这些基因在18个月明显偏向右上方，也就是这些基因在18个月表达更多，而且是与有Aβ斑块的位置趋近的。

Mic1是AD-associated microglial signature的缩写，是小胶质细胞中与AD相关的基因群，

Mic1基因群中的一部分，它们的位置也是在18个月的时候向右上方偏过去的。这就是说这些基因在18个月的时候也是与Aβ斑块的位置趋近的。

作者对两个野生型小鼠，和两个AD小鼠，做原位测序。一共测84个基因。

A图是整个切片的原位测序图，

B图是A图中海马部分的放大图，

C图是被检测的84个基因。这些基因被标的颜色，是按照这个基因主要会出现在哪种细胞中，来标颜色的。

这其中，主要出现在神经元中的基因被标红色，出现在小胶质细胞中的被标黄色，出现在星形胶质细胞中的被标绿色，少突胶质细胞的是被标蓝颜色。

D图中，是从Aβ斑块为圆心，从里向外画圆圈，从第一圈一直画到第五圈，

F图中，是按RNA出现的位置到Aβ斑块的圆心，进行打分，离得越远，分值越低，离得越近，分值越高。

这是空间转录组与原位测序第一圈的对应关系。

横轴是原位测序得到的第一圈的富集水平，

纵轴是Aβ斑块边上，该基因的表达改变。

可以看到，大多数基因的表达，在两种体系中是有一致性的，

除了C1qb这个基因，C1qb是一个补体的基因。

作者把PIG基因群的每个基因对应有表达的脑细胞类型列出来。

这里，纵向的，是一个个的基因。

横的排列的，是野生型小鼠、AD小鼠、和AD小鼠有Aβ斑块的点旁边，这三种情况

然后，再细分成星型细胞、小胶质细胞、神经元、少突胶质细胞。

可以看到PIG基因群主要是在小胶质细胞中起作用，

还有一小部分是在星形细胞中起作用

有几个特别的点，

Serpina3这个基因，在野生型的小鼠中，是在神经元中表达的，但是在AD小鼠中，是在星形细胞中表达的

Apoe和Cts1这两个基因，在有Aβ斑块出现的地方，出现在小胶质细胞中

这是对补体基因群做的分析。

可以明显地看到在AD小鼠中，和AD小鼠的Aβ斑块的周围，这些补体基因在小胶质细胞中有高度的富集。

补体是免疫系统的组成部分，这再次说明了AD小鼠脑中的Aβ斑块与免疫反应的关系。

实验内容的第四节，PIGs基因群内部的共表达关系

接下来，作者要看PIGs基因群的共表达关系，可以看到，这些基因分成了三组，作者用橙、绿、蓝把这三组基因标示出来，组内的关联比较强，而组间的关联比较弱。

其中，蓝色和橙色的基因主要是在小胶质细胞中表达，

而绿色的基因主要在星形胶质细胞中表达。

而且，在野生型小鼠中，橙色的这些基因几乎没有关联。

接下来作者在AD小鼠脑中按Aβ斑块的多少分别来看表达关系。

Q1是Aβ指数最高的区域，Q2其次，Q3再次，这样一直排到Q4，

我们可以直接地看到，Q1中的绿色连线是最密的，依次排下去，Q4的连线密度最低。

也就是说，Aβ指数越高，PIG基因间的共表达的联系越紧密。

最强的联系，是在Ctsd和C1qa、C1qb、Ctsb、Ctss、Hexb之间。

还有在Apoe和C1qb之间

橙色部分与另两个部分之间最强的联系，是在Trem2和Tyrobp与Ctsd、B2m、Apoe、C1qa、C1qb、Hexb、Ctss之间。

实验内容的第五节，OLIG基因模块

前面，我们说了富集到purple的点，包含的是PIG基因群，

接下来看这个的red的点。这个red的点包含了165个基因。而且这些基因主要是在oligodendrocyte，也就是少突胶状细胞中表达，作者把这些基因命名为OLIG基因群。

这是把OLIG基因群在GO中进行富集得到的结果。

很明显，这些GO条目都与神经元纤维外面的保护套有关

OLIG中前10个枢纽基因：Plp1, Mbp, Mobp, Cldn11, Mal, Apod, Cnp, Trf, Fth1, and Plekhb1，与髓磷脂相关

这是WGCNA得到的各个点，与各细胞种类的基因表达的交叠关系图，

可以清楚地看到red这个点包含的基因都落在oligodendrocyte，也就是少突胶质细胞这个格子里的

这是各个点与以往的数据集中包含的基因的交叠的情况。

Red与Oli0这个数据集有明显的交叠，Oli0是一个与AD相关的少突胶质细胞的数据集

Purple的这个点，是与Mic1这个数据集有明显的交叠，而Mic1是一个小胶质细胞的数据集

图中，是对比AD小鼠3个月与18个月的OLIG基因群的表达，打网格线的部分是表达没有明显变化的部分，红色是明显上调的部分，绿色是明显下调的部分

可以看到3个月和18个月时候，小鼠脑中大部分区域者打的网格线，特定区域是红色的，还有少量特定区域是绿色的

发现，OLIG基因群并不是在Aβ斑块多的地方表达就多，而是在脑子里特定的区域决定这里OLIG基因群表达的多少。

也就是说OLIG基因群表达的主要驱动力是大脑区域，而不是有多少Aβ斑块。

实验内容的第6节，人脑中PIG和OLIG模块的可视化

作者除了分析小鼠大脑样本之外，又做了人的大脑样本的分析。

具体是取三名患老年痴呆的患者死后的大脑，和三名正常人的死后的大脑做分析。这是原位测序得到的图。

左边的这张图，紫色的光斑，是有PIGs基因表达的位置。PIGs基因群主要集中在大脑的灰质部分

右边的这张图，红色的光斑，是有OLIG基因表达的位置。OLIG基因群表达的位置主要集中在大脑的白质部分。

这与预期是一致的。

这是PIG基因群在人脑中的表达情况，

在Aβ斑块周围变得高表达，或者低表达的基因，在这里被标示出来

我们可以看到，红色箭头标的这几个基因，在AD病人和正常人的脑中，有较大的差别。

这是OLIG基因群在人脑中表达的图谱，

同样，在Aβ斑块周围，基因表达的变被标出来。这其中有22个基因是明显降低的，5个基因是明显升高的。

有趣的是APOD这个基因，它是一个编码脂蛋白的基因，已知它在AD病人脑中表达上调。现在又发现它在AD病人的小胶质细胞中有富集。

总结