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在上周的直播中，陈巍老师为大家分享了《确认新冠病毒感染所必需的宿主基因》，小编把PPT内容给大家整理出来啦！想看视频还可以扫描下方二维码观看回放。

 

 

科学家用全基因组CRISPR敲除扫描技术结合单细胞测序来确认宿主中对新冠病毒感染所必需的基因，发现液泡ATP酶等一系列基因与新冠病毒感染宿主有关，再用RNA干扰等方法来验证了这些基因在感染中起到的作用，并且进一步发现增加胆固醇的生物合成和阻隔

ACE2能减少感染。‍

 

文章概要

文章的题目是《Identification of Required Host Factors for SARS- CoV-2 Infection in Human Cells》，文章发表在Cell杂志的2020年10月刊上。

文章题目，翻译成中文，就是《鉴定人类细胞中SARS-CoV-2感染所需的宿主因子》

文章的通讯作者，是Neville E. Sanjana，他是纽约大学，Grossman医学院神经科学与生理学系的副教授

实验结果分析

第一部分，是CRISPR干扰与病毒感染实验

第一步，是做CRISPR干扰文库。这个CRISPR库包含了12万个sgRNA，针对1万9千个人类基因。

CRISPR干扰库，是一个慢病毒的载体，sgRNA被插入到载体上，载体上还有Cas9基因，Cas9基因产生的酶，可以把sgRNA的序列插入到细胞基因组的特定位置上去

载体上有抗嘌呤霉素的基因。这个抗嘌呤霉素的基因，可以在有嘌呤霉素的条件下，把已经被转了基因的细胞给筛选出来

被转染的细胞，是A549这个细胞系，A549是一个肺的上皮细胞系，而且作者把这个细胞事先做了转基因。被转入的基因是ACE2这个基因，而且转基因后，ACE2基因在A549细胞中持续表达。

ACE2是已知的肺细胞表面能与新冠病毒结合的受体，并且ACE2会介导新冠新毒进入肺细胞。

把CRISPR干扰库，做成慢病毒库，来转染培养的A549-ACE2细胞。用嘌呤霉素来筛选细胞。能在嘌呤霉素作用下活下来的细胞，都是被转染了这个有抗性的慢病毒的细胞。

接着，用新冠病毒来感染这些活下来的细胞。

新冠病毒感染后6天，收集细胞，进行10x单细胞测序。

把新冠病毒感染后细胞，与感染前的细胞的RNA测序数据做对比分析。

这是免疫荧光法展示的新冠病毒对A549-ACE2细胞的感染。

左图中红色荧光就是对新冠病毒的核衣壳蛋白染色，发出的红光。核衣壳蛋白的英文是nucleocapsid，也就是图中的CoV-2 N蛋白。

对照之下，我们可以看到没有被感染的细胞周围没有红色荧光，也就是没有病毒的核衣壳蛋白

左边的C图，是培养细胞被两种浓度的新冠病毒感染之后，细胞的生存率，同时还有没有被感染的细胞做对照。

结果与作者的预期是一致的，新冠病毒感染之后，大量细胞死亡，只有小量的细胞生存下来。

并且，加入的新冠病毒浓度越高，生存下来的细胞数越少。

右边的D图，是对新冠病毒感染前和感染后，细胞中表达的guide RNA进行测序分析得到的散点图。

可以看到，散点图的分布，是偏离了对角线的。也就是说，在新冠病毒感染之后，guide RNA的分布是发生了明显的变化的。

一个很自然的推测，就是在感染后生存下来的细胞中，很可能是更加富集的这些guide RNA帮助细胞生存下来，或者说是这些guide RNA干扰抵抗了病毒的杀细胞作用。

接着，作者就对感染后细胞中富集的guide RNA做了分析。

这里的E图，就是富集分析得到的火山图。这些被标出了名字的基因，就是富集的guide RNA对应的基因，富集倍数超过了4倍，而且P值小于千分之1的基因。

实验内容的第二部分，对与感染相关的基因进行富集

把富集的前50个基因，按照其功能分组，可以得到这张图。

先是病毒粘到细胞膜上，注意一下，在这里有一个ACE2基因，也就是“血管紧张素转化酶2”基因，它对病毒粘到细胞膜上很重要，后面还会再次提到这个基因

然后，细胞把病毒内吞进去

接着病毒外面的刺突蛋白被切断，并且病毒的外膜被融化掉

再接着是内涵体循环

下面是RNA复制，和RNA转录

接下来是内质网高尔基体转运

最后，复制出来的病毒RNA和新合成的病毒蛋白组装成新的病毒，释放到细胞外面

富集的基因，按这些基因的蛋白产物，参与组成的蛋白复合物，进行分类排序，可以看到，集中在液泡ATP酶复合物中的基因最多，

其次是与回收体和内涵体相关的基因

对富集的基因做GO分析，可以看到最富集的GO条目是转铁蛋白转运和吞噬体酸化

作者把富集的基因，在数据库中找对应的人体全身各器官的表达数据，做对比，几乎所有被富集的基因都在全身所有的器官中有表达。

只有ACE2这个基因，特定地集中在睾丸、小肠、肾脏、和心脏中高表达。

实验内容的第三部分，富集的基因与病毒蛋白相互作用，并且这些基因对其它病毒感染宿主也很重要

经过质谱分析蛋白质之间的亲和力，再与CRISPR筛出来的基因做对比，

发现来源于人的ATP6AP1蛋白与病毒的非结构蛋白6有最强的亲和力，而ATP6AP1基因在CRISPR筛查中排名第二

另一个人的蛋白，RAB7A，与病毒的非结构蛋白7的亲和力排在第二，而RAB7A基因在CRISPR筛查中排名在前50名。本节讲座后面部分还会再提到RAB7A这个蛋白，这个蛋白在内吞过程中起重要作用

在CRISPR筛查排名前50的基因中，有22个基因表达的蛋白与新冠病毒的蛋白有相互作用。

作者对比了新冠病毒、赛卡病毒、H1N1型的流感病毒，把这三种病毒用CRISPR筛查富集得到的相关的人基因。

结果发现，新冠病毒与赛卡病毒，富集得到的人的基因，比较相近，

而新冠病毒与H1N1型的流感病毒的结果相去较远

三个病毒共享一组基因，就是ATP酶质子泵，这些ATP酶质子泵基因对于酸化和内涵体处理过程起到至关重要的作用。

第四部分实验结果分析，用基因敲除法、RNA干扰和小分子抑制剂验证富集的基因

作者在前面筛出来的前200个对病毒感染影响最大的基因中，挑了30个基因，分别做CRSIPR靶向干扰，再用新冠病毒对细胞做感染。

左边的图是CRISPR的干扰后，做western blot的结果，检测目标蛋白的表达量，可以明显地看到，目标蛋白的表达量急剧下降，达到几乎看不见的状态。

右图，是对经过CRISPR干扰的细胞，用新冠病毒做感染。

可以明显地看到，没有被靶向处理过的细胞，被红色荧光包围，也就是被新冠病毒包围

而经过CRISPR干扰的细胞，表面的新冠病毒数量要少许多。

这是30个基因，被分别用CRISPR干扰后，再用新冠病毒感染，看有多少细胞被新冠病毒感染

最左边的这个灰色的柱子，是空白对照。

我们可以看到，相比于最左侧的空白对照，所有被CRISPR干扰的细胞，再被新冠病毒感染的细胞数都是下降的。

也就是说，在这些基因被干扰后，病毒感染这些细胞的能力都下降了。

各个被靶向干扰的基因，它们对应的被感染的细胞比例，与之前CRISPR干扰引起的基因表达的增加，有明显的负相关性。

也就是CRISPR干扰能引起的这个基因表达增加越多，则被感染的细胞数越少。

相关系数是-0.6，而P值是万分之五，显著性很高。

接着，作者针对9个CRISPR敏感的基因，找了26个靶向的小分子化合物来做实验

用这些小分子化合物处理被新冠病毒感染的细胞，处理36个小时之后，用定量PCR方法来测病毒的数量。

图中，横轴是病毒数量的改变，

纵轴排列的就是这26个小分子化合物。

这里，红色的柱子是病毒减少程度超过100倍的化合物。

其中，Autophinib和ALLN这两个药物让病毒减少的程度超过1000倍。

注意一下，图中灰色的最长的柱子，是大名鼎鼎的药物“瑞德西韦”，也就是在疫情期间，被中国网络戏称为“人民的希望”的这个药物。

从这张图中，可以看出瑞德西韦这个药物至少在体外培养的细胞水平上，表现出了极强的对病毒的抑制作用。但是，瑞德西韦针对性地抑制从RNA到RNA的这个RNA复制酶，这个酶是新冠病毒自身的基因编码的，不是由人的基因组编码的。

所以，在图中没有列出瑞德西韦针对的人的基因。

作者接着做了小分子化合物组合，对减少病毒的效果。

图中，横轴排列的小分子化合物，和组合化合物。

纵轴，是病毒减少的程度，越向下，病毒减少的程度越大。

红色的柱子是减少超过100倍的化合物组合。我们可以看到，有好几个组合的效果是超过100倍的。

第五部分实验结果，单细胞测序确定胆固醇生物合成是与CRISPR扫描富集基因相关的

作者用ECCITE-seq来寻找与新冠病毒相关的生物过程。

ECCITE-seq方法的工作原理，如图所示。

它的基本原理还是10X的单细胞RNA测序。

但在常规的RNA测序之外，还加上了对guide RNA的追踪，

并且对带有核酸标签链的、针对细胞表面蛋白的抗体有追踪。

对ECCITE-seq有深入兴趣的同学，可以到网上找一下【陈巍学基因】的第68期视频:ECCITE-seq一次实验检测5种单细胞信息。

这是经过sgRNA和新冠病毒处理的细胞，用ECCITE-seq得到的基因表达热图。

横向排列的是有明显富集的被干扰的基因，纵轴是有响应的基因。图中的黄颜色，显示处理后这个基因高表达，紫红色表示这个基因低表达。

我们可以从图中看到，每个被干扰基因都会对应有一些特征的色块，也就是说每种对这些基因的干扰，都会对其它某些基因的表达造成影响。

把上调的基因，对应到的生物通路。

可以看到有6个基因，就是图中红色下划线标出的这些基因，这些基因造成相似的基因表达特征，而这6个基因都是内涵体进入细胞的通路的组成部分

这6个基因的干扰都引起胆固醇生物合成上调。

这张图是分别被上述6个基因干扰后的细胞，它们的胆固醇表达的情况。

最下面是对照组中的胆固醇的含量。

上面的，是6个基因干扰后的胆固醇的含量的情况，可以看到各个基因被干扰后，胆固醇分别有10到50%的增多

这表明增加胆固醇，与增加细胞对新冠病毒的抗性有关。

氨氯地平是一种钙离子通道拮抗剂，并且能增加细胞内胆固醇的合成，在A549细胞中加入氨氯地平看实验效果。

实验结果表明，氨氯地平能增加胆固醇的表达，

经过qPCR检测病毒RNA，发现氨氯地平能减少新冠病毒的数量

另外，用病毒吃掉培养细胞形成的细胞空斑来测试，加了氨氯地平的那一组，空斑的数量明显减少。也就是说氨氯地平在细胞实验中，有抗新冠病毒的作用

第六部分实验结果，对RAB7A的基因敲除会导致细胞表面ACE2蛋白减少和内涵体中积累ACE2蛋白

已知，ACE2蛋白对新冠病毒进入细胞是必需的，作者就考虑有什么办法来降低ACE2蛋白的表达，或者减少ACE2蛋白到达细胞的表面，这也许是一个减少新冠病毒感染的方法

RAB7A基因表达的RAB7A蛋白是一个GTP酶，同时它参与细胞内吞作用。

因为RAB7A这个名字太长，下面我将会把它称为R基因，或R蛋白，以方便讲课。

这里，是对有ACE2转基因的A549细胞做针对R基因的CRISPR敲除。

然后，看ACE2蛋白的表达量。这个图是处理过的细胞用流式细胞仪来看ACE2的表达量。

最上面一行是野生型的A549细胞，它很少表达ACE2蛋白。

第二行是被转了ACE2基因的细胞，大量表达ACE2蛋白。

第三行和第四行，是被转了ACE2基因的细胞，再被做了针对R基因的基因敲除。可以看到这两组细胞表达的ACE2蛋白要比之前第二行的细胞表达的ACE2蛋白少。

这个实验，说明了R基因对ACE2的表达有正向的促进作用。

作者又对之前扫描得到的一系列基因做基因敲除，看ACE2的蛋白表达。

可以看到，敲除R基因导致的ACE2蛋白降低，是最明显的。

这是荧光免疫组化看到的结果

左边两张图是空白对照，可以看到ACE2蛋白分布在细胞膜上和细胞质内。

右边两张，是R基因被敲除后，ACE2蛋白集中在类似内溶酶体的小泡状空心结构中。

进一步研究，看在R基因被敲除的细胞中，ACE2蛋白与别的哪些蛋白在一起。

第一张图是ACE2蛋白的染色图，

第二张图是EEA1的染色图，EEA1是早期的内涵体标志蛋白，

第三张图是Lysotracker蛋白，lysotracker是溶酶体的标志基因。

第四张图，可以看到ACE2主要是与EEA1蛋白在一起，也就是ACE2主要在内涵体内；

第五张图，可以看到少量的ACE2与Lysotracker蛋白在一起，也就是ACE2蛋白有少量在溶酶体里

之前的大部分的实验，都是在被转了ACE2基因的A549细胞上做的，但这种情况下ACE2蛋白是过表达的。作者还想看看别的细胞中，ACE2基因的表达会不会受R基因的影响。

作者找了两种细胞，肺细胞Calu-3，和结肠细胞Caco-2来做实验。

这是用流式细胞仪看高表达ACE2蛋白的细胞的占比，结果发现，敲除了R基因后，细胞膜上有大量ACE2蛋白的细胞，在所有细胞中的占比大幅下降。

这进一步支持了这样的观点，就是缺少了R基因后，ACE2蛋白会在细胞质中积累，而在细胞膜上的A蛋白会大量减少。

这是在Caco-2细胞中敲除R基因，看ACE2蛋白定位。

左边是对照组，也就是没有敲除R基因的情况，图中紫红色的点，是ACE2的聚集点

中间是敲除R基因的实验组，可以看到实验组里有大量的ACE2蛋白聚集的点。

最右边，是对ACE2聚集点的面积做比较的柱图，

可以明显地看到R基因被敲除后，ACE2蛋白更多地聚集中细胞内部。

再结合前面R基因被敲除后，ACE2蛋白在细胞膜表面减少的结果，更加支持了R基因有帮助ACE2蛋白转运到细胞膜表面的功能的结论。

总结