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文章的题目，是：Single-Cell Analyses Identify Brain Mural Cells Expressing CD19 as Potential Off-Tumor Targets for CAR-T Immunotherapies

翻译成中文，意思是《单细胞分析鉴定表达CD19的脑mural细胞为CAR-T免疫疗法的潜在非肿瘤靶标》

文章的通讯作者是Denis Migliorini，他是宾州大学 Parker肿瘤免疫研究所的博士后研究员

 

 

1

CD19基因与CAR-T治疗的关系

CD19基因

CD19基因全称是B淋巴细胞抗原基因CD19，表达穿膜蛋白CD19

CD19在B淋巴细胞的发育各期都有表达

针对CD19的CAR-T治疗有效、也有毒

对于难治性B细胞淋巴瘤，用针对CD19的CAR-T治疗，有效率达到40~70%

同时，39~64%的受治病例发生神经毒副作用

作者估计大脑中有表达较高水平CD19的细胞成了CAR-T攻击的靶标

所以，作者要想搞清楚，在大脑中是什么细胞表达了CD19

是否是因为CAR-T针对脑中的CD19的攻击，引起了神经毒副作用

 

 

2

实验结果分析

我们先看第一部分的实验结果，

通过单细胞RNA测序，来鉴定人脑中CD19阳性的mural细胞

作者首先分析了2364个人前额叶皮层来的单细胞RNA测序数据，把这些数据做了聚类。

在聚类后的数据中，排除掉了神经性的细胞、神经前体细胞、和红细胞

剩下的细胞簇，再做UMAP图，分成星型细胞、淋巴细胞、微胶质细胞、少突胶质细胞、周细胞和内皮细胞。区分这些细胞，都是通过一系列经典的marker基因的表达来做的

作者惊奇地发现，有一小部分细胞，

这些细胞同时表达CD19和mural细胞的marker基因CD248

但这些细胞不表达B细胞的marker基因CD79A。

这说明，在大脑里，是有表达CD19基因的细胞的。而且这些细胞不表达B细胞的marker基因CD79A，说明这些细胞既不是B细胞，也不是混合有B细胞的双细胞。

作者进一步观察到这些细胞还表达CD81基因，而CD81蛋白是CD19的伴侣蛋白。

CD19本身是一个跨细胞膜的蛋白，它需要CD81蛋白的帮助，来完成跨膜动作

作者还在细胞簇的表达中，看到了淋巴细胞簇，淋巴细胞簇表达CD3、CD7、IL2RG等marker基因

而周细胞表达的基因，与淋巴细胞簇表达的基因，是互斥的。

这个进一步说明了，在大脑中表达CD19的细胞，不是淋巴细胞，而是周细胞

这是对周细胞中CD19表达水平的分析

CD19基因的表达量，在周细胞的所有基因的表达量中排序，排到前86%的位置

同时，可以看到周细胞中其它几个marker基因的表达水平，CD248是前85%，RGS5是前96%，PDFGFRB是前97%

也就是说，在周细胞中，CD19的表达水平是较高的。

作者找了更多的数据集来进行分析

在一个人类前脑的数据集中，mural细胞是表达CD19的，但不表达CD79A

作者在第三个数据集中，进一步做分析，

在周细胞中，有较多细胞是表达CD19的，但这些细胞不表达B细胞的marker基因CD79A。

在内皮细胞中，有少量细胞是表达CD19的，但这些内皮细胞都不表达CD79A

在La Manno的两个数据集中，

周细胞中的CD19表达量，分别是所有基因排名的前86%，和前71%

这也说明CD19在mural细胞中、周细胞中的表达水平是较高的。

我们接着看第二部分的实验结果，

用免疫组化来检测成人大脑的CD19表达

为了评估在人脑mural细胞中的CD19的表达，作者做了免疫组化。

样本来自健康死亡的人，我估计是死于车祸之类的人的大脑。

用的抗体的编号是BT51E。这个抗体是识别CD19蛋白的C末端的，C末端是位于细胞质这一面的

免疫组化的结果可以看图，图中在：海马、岛突、颞叶、脑桥、额叶、枕叶、顶叶等位置，都发现了有染色，也就是图中用黑色箭头标的这些位置。

也就是说在大脑的各个位置都有CD19的表达

我们接着看第三部分的实验结果，

周细胞和血管平滑肌细胞的分析显示各种mural细胞的CD19表达

为进一步分析大脑在各个发育时期的CD19的表达，

作者找到了BICCN的数据集，BICCN数据集是BRAIN initiative Cell Census Network的缩写

作者找了来自101个样本85万7千个细胞的数据，这些样本都是不同发育时期的胚胎人类大脑

作者把这85万个细胞的数据做了整合，整合出了885个元细胞

接着，对这些元细胞做聚类分析，得到UMAP图，这张UMAP图是按元细胞的胎龄来标的颜色，颜色越深，胎龄越大

这是按转录组相似性分出来的细胞簇，不同的簇用不同的颜色进行表示

在元细胞中，我们可以清楚地看到，有CD19的表达。

同时，我们可以看到，这些元细胞中，有未分化的祖细胞marker基因PAX3的表达

和周细胞的几个marker基因的平均表达水平。

可以看到在mural元细胞簇中，周细胞marker基因特异性高表达

也就是CD248这些细胞在第6号的元细胞簇中特异性地高表达

在这张图中，

横座标是周细胞marker基因的表达水平

纵座标是CD19基因的表达水平

我们看到，CD19基因的表达水平，和周细胞marker基因的表达水平，有强相关性

作者还发现，在小胶质细胞簇中，CD19低表达

这三张图，分别是三类基因在胚胎各个阶段的表达情况

从上到下，胚胎的胎龄越来越大，

每个小柱子的高度，表示有多少个元细胞表达这些标志基因。

可以看到，胎龄15周之前，没有观察到CD19的表达。

并且，在这些细胞中， 没有观察到B细胞的marker基因的表达。

这是marker基因表达的热图。

图中分成两块，左边这块，是属于神经血管的元细胞

右边这块，是神经血管之外的元细胞，

我们可以看到，神经血管的元细胞的marker基因表达，与非神经血管的元细胞的marker基因表达，差异很大。这让作者可以清楚地把两群细胞给分开。

而且，我们可以看到CD19在神经血管的细胞中，有高表达，

在别的细胞中，CD19的表达量很低

进一步的数据分析，可以看到，CD19不仅在周细胞中表达，

还在内皮细胞中有表达

接着，作者把非神经元的细胞亚群，做成UMAP图，并且把这些细胞分别按细胞簇、时间、空间，做了区分

接着，作者做了各种细胞对应marker基因的表达

可以看到CD19的表达，与血管平滑肌细胞、周细胞、内皮细胞，是有交集的。

这是从发育的时间轴上看各marker基因的表达。

横轴是发育的时间轴，

可以看到，15周胎龄之前CD19的表达很少，

20周之后，有CD19的表达

我们接着看第四部分的实验结果，

在成年人的大脑中表达CAR-T细胞识别的CD19亚型

为了看不同年龄的人的大脑中CD19基因的表达，作者找了500个人类大脑不同时期、不同大脑部位的样本进行分析

图中蓝色的点是出生之前的大脑样本中CD19基因的表达情况，

棕色的点是出生之后，一直到40岁，大脑样本中的CD19基因的表达情况。

我们可以看到自始至终，大脑一直都有CD19的表达。

同样，我们可以看到，

CD248这个mural细胞的marker基因，也自始致终有表达

令作者吃惊的是，CD248, CSPG4, ANPEP, FOXS1, 和FN1这些基因的表达与CD19的表达的相关性，排在前1%

作者对与CD19表达相关性最高的200个基因做GO富集，

发现富集的条目是与神经血管单元、血管生长、对流体切变力的响应、和多种细胞外间质，这些条目紧密相关

这提示，CD19在成年人大脑中的表达，与mural细胞的丰富程度有关，而与B细胞不太有关系。

看各种细胞中含CD19和marker基因的含量

CD19和CSPG4在周细胞与内皮细胞中表达较高。

B细胞中富集的CD22和CD74，在周细胞与内皮细胞中表达较少

临床上使用的针对CD19的CAR-T是针对CD19的第4个外显子的。另外，跳过第2个外显子的CD19的突变蛋白，会缺乏向细胞表面的转运，

因此，作者分析了大脑中表达的CD19的各个外显子的表达水平。

图中，从左到右分成15段，每一段就是一段CD19的外显子。

可以看到，各个外显子的表达均匀分布，包括外显子2和外显子4，都是均匀分布的

我们接着看第五部分的实验结果，

针对CD19的CAR-T细胞治疗小鼠模型的神经毒性分析

作者为了了解小鼠mural细胞中是否有CD19的表达，进行了研究。

从健康的C57BL/6J小鼠中提取并分离了全脑。并通过流式细胞仪的分析，

证明了有表达CD19的细胞存在，尽管表达CD19的细胞的数量较少。

相比于人类大脑中的CD19的表达水平，小鼠大脑中的CD19的表达水平相对较低。

作者针对小鼠和人类的CD19分别做CAR-T细胞。

一共做了三种CAR-T细胞。CAR-T细胞的CAR分子设计中有两个关注点：

1、左边针对的目标分子有两种，一种是针对小鼠的CD19，另一种是针对人类的CD19，小鼠的就用字母m开头，人类的就用字母h开头

2、第三段基因片段，有两种选择，分别是4-1BB和CD28

这样，就有了三种CAR分子

然后，作者对两种培养细胞，用三种CAR-T做了CAR-T的裂解实验。

被裂解的两种培养细胞，分别是人类的、和小鼠的。

左边的这是Nalm6细胞，是培养的人类细胞。

我们可以看到，是红线的裂解率最高。也就是针对人类CD19的CAR-T对Nalm6这种人类的细胞的杀伤力最强。

右边的这是A20细胞，是培养的小鼠细胞。

我们可以看到，是绿线的裂解率最高。也就是针对小鼠的CD19，并且用CD28作为CAR分子第三段的这种CAR-T，它的裂解率最高

接着，作者对特殊的NSG小鼠做CAR-T处理。

这种NSG小鼠的特点是它是免疫缺陷的，它没有B细胞。

之所以选用这种小鼠，是因为本项研究，就是看针对CD19的CAR-T治疗对B细胞之外的细胞、器官造成的伤害。那么NSG小鼠没有B细胞，实验过程中就可以排除因为CAR-T进攻B细胞造成的伤害，所观察到的伤害，都排除了B细胞的影响。

我们看图，图中是NSG小鼠在经过CAR-T处理后，大脑的切片染色结果。

蓝色是DAPI染色，是对细胞核的染色。

红色是EBD染色，体现的是血脑屏障的渗漏。

图片分两排，上面一排是大图，下面一排是上面大图中那些小白框内的图形放大后的效果。

图片分5列，最左边的一列，是甘露醇。甘露醇是能够让血脑屏障的渗透性变高的一种化合物，在这里，相当于一个检测血脑屏障的阳性对照。

第二列，没有加T细胞处理，也就是阴性对照。

第三列到第五列，是3种CAR-T细胞的处理结果。

可以明显地看到，第五列的图中，红颜色是较明显的。也就是说，针对小鼠CD19的用CD28做基因第三段的CAR-T，较大程度地增加了小鼠血脑屏障的渗透性

这是对刚才图像中EBD染色效果的荧光进行定量分析的结果

可以看到mCD1928z这个CAR-T处理，可以引起和甘露醇相近渗漏结果

另外，mCD19BBz这个CAR-T处理，也会引起一定的渗漏结果

这是作者用另一个“有免疫功能的”小鼠做血脑屏障渗漏实验的结果。

我们可以看到，在mCD1928z这个CAR-T处理的结果中，可以看到较强的红颜色荧光。

作者还用核磁共振技术，来检查了小鼠经过CAR-T治疗之后，血脑屏障的渗漏结果。

这张图中，脑子部分渗漏的情况越重的，颜色标得越偏红。

可以看到，甘露醇处理的脑子，颜色最偏红，

而余下的4个样本中，是用mCD1928z这个CAR-T处理后的脑子，颜色最红。

最右边的图，是对核磁共振检测到的小鼠大脑的渗漏情况做一个定量的分析。

也还是mCD1928z这个样本的渗漏，在各个实验样本中是最高的

这是作者把CAR-T处理后四天的小鼠脑组织解离后，用荧光流式细胞仪来做检测，看其中的表达CD19的细胞的数量。

上面的图，是检测有CD45或CD41的细胞中，同时有CD19表达的细胞，

下面的图，是检测有CD13的细胞中，同时有表达CD19的细胞，

我们可以看到，针对人的CAR-T和针对小鼠的CAR-T分别处理后，针对人的这组剩下的有CD19表达的细胞的比例，都高于针对鼠的这一组。

量化的计算，也是这样的结论。也就是说针对鼠的CAR-T对表达鼠CD19的细胞杀灭功能较强

我们接着看第六部分的实验结果，

人脑mural细胞特异性CD19表达

作者接着做了脑与肺的mural细胞表达分析。之所以要做肺的mural细胞表达，是因为肺当中的周细胞特与内皮细胞特别多，作者想看这些细胞的基因表达与脑的mural细胞的表达有什么差异，以便为未来的CAR-T治疗找到方向。

经过分析，作者发现CD19在大脑中特异表达，而在肺中几乎没有表达。

而一些mural细胞的marker基因，如PDGFRB、RGS5、FOXS1和KCNJ8，在大脑和肺脏中都有表达

之前已经有科学家提出了用针对两种目标抗原的，分别用“AND”或“NOT”方法来精选目标细胞的CAR-T治疗方法。

所谓AND，就是要对同时有两种特定抗原的细胞，CAR-T才会启动杀灭功能

那NOT，就是有A目标抗原，但没有B目标抗原的细胞，CAR-T才会启动杀灭功能

那么现在有了精细的各种细胞的marker基因，也就为接下来的CAR-T研究提出了新的可行思路。

 

 

3

总结

最后，我们做一下总结

1、大脑的周细胞和内皮细胞中有表达CD19

2、针对鼠CD19的CAR-T会攻击鼠的大脑，并造成小鼠大脑的渗透性增加

3、针对两个特征抗原的、有组合识别功能的CAR-T，也许能辟免或减少非特异的CAR-T杀伤，可能是一个未来的研究方向