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目前同时检测单细胞RNA-seq和单细胞表面蛋白的技术已逐步走向成熟，科学家更想要同时检测细胞内的蛋白表达。在本次直播课中，dafabet黄金手机版学院邀请了“陈巍学基因”创始人陈巍老师来为大家分享，Ido Amit的团队提出的同时检测单细胞RNA转录和细胞内蛋白表达的方法，并用这个方法来检测细胞内蛋白活性、转录因子结合力等细胞特性。‍

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文章的题目是《Coupled scRNA-Seq and Intracellular Protein Activity Reveal an Immunosuppressive Role of TREM2 in Cancer》，发表在cell杂志2020年8月份这一期上。

文章的题目翻译成中文，意思是《耦合的单核RNA-Seq和细胞内蛋白活性揭示了TREM2在癌症中的免疫抑制作用》

文章的通讯作者是Ido Amit，他是以色列，Weizmann科学研究院的教授。

INs-seq是什么

INs-seq是一种基于单细胞测序检测RNA表达，同时结合了荧光流式细胞仪检测细胞内的目标蛋白含量的新方法

它的用途，是可以检测：

细胞信号

代谢

转录因子

INs-seq工作原理，是先对组织做解离，把组织解离成单个细胞

接着把细胞做固定，和通透化。固定，目的是让细胞内的蛋白不会漏到细胞外面去；通透化，也可以理解成是对细胞膜打孔。通透化的目的，是让外面的抗体可以进到细胞里面去。

接着，用带荧光标记的抗体来处理样本，抗体可以进到细胞里面去，与目标蛋白进行结合。

接下来，把经过荧光抗体处理的细胞群，

用流式细胞仪进行分选，把有荧光、和没荧光的细胞给分开

分选后的细胞，做单细胞文库

接下来一部分做单细胞测序，另一部分做细胞的信号图谱

实验结果分析

实验内容分6个部分，我们来说第一部分的实验内容：INs-seq的实验方法验证

Ins-seq最重要的步骤就是固定细胞的步骤，

作者比较了INs-seq和其它三种方法的固定效果。

这里有5张图，

图的横轴都是做流式细胞仪实验，得到的细胞内的荧光强度，

纵轴是细胞计数。

每张图中有两个峰：浅色的峰是对照组的，灰色的峰是脂多糖处理组的。

Fresh这组，是用没有做固定的新鲜样本做实验，相当于是固定效果的阴性对照组，结果control和LPS两个峰重合在一起了

INs-seq这一组，我们可明显地看到，浅色的峰和灰色的峰的分离效果是最好的。

其它的三组，浅色的峰和灰色的峰的分离效果都没有INs-seq这组好。

为了分进一步判定几种处理方法得到的cDNA的质量，作者把几种方法处理的样本，抽提RNA，再反转录成cDNA，

接着做RT-qPCR实验。

可以明显地看到INs-seq方法得到的cDNA，它在做RT-qPCR时，需要的循环数是最少的，

INs-seq得到的cDNA放置两周后的循环数，只是略大于INs-seq好之后立即做RT-qPCR的循环数。

注意：RT-qPCR的循环数越少，说明起始的模板量越多。

再看其它三种固定方法，循环数都明显大于INs-seq方法的循环数。

接下来，作者比较了INs-seq和新鲜样本，每个细胞产生的UMI数，

INs-seq样本的每个细胞的UMI数

比新鲜细胞的UMI数少50～60%

好在，各个细胞的UMI数的减少是较为均匀的。

E图是新鲜样本，与INs-seq样本的细胞聚类后的UMAP图，我们可以看到两者细胞的聚类分布是高度相似的

F图是把聚类出的四个簇的数量进行定量的计算，我们可以看到，INs-seq样本与新鲜样本的聚类结果差得不太多

作者进一步拿三个人的外周血单核细胞样本中的CD45阳性细胞，做新鲜样本与INs-seq样本处理的结果对比。

可以看到新鲜样本与INs-seq处理的样本的结果相近。

由此，说明了Ins-seq有较好的固定效果，并且做表达分析时，Ins-seq样本的效果与新鲜样本的效果相近

接下来，我们来说第二部分，用INs-seq方法，将树突细胞按p38蛋白的表达进行区分

为了更好地了解各种髓样细胞对病原体信号响应的复杂性，

作者用脂多糖刺激了骨髓培养细胞，

做了INs-seq固定

接着针对TLR4信号级联反应的下游成份p38的蛋白，做细胞内染色，

再用流式细胞仪根据荧光光强做了分选，

并用10x仪器做了单细胞处理。

这是流式细胞仪对细胞上p38蛋白的荧光强度的扫描结果

可以看到，图中有两个峰，

浅色的峰是对照组细胞的p38蛋白的荧光分布，

深灰色的峰是用脂多糖处理过的组的p38蛋白的荧光分布，可以明显看到p38蛋白在脂多糖处理组中表达较多，而在对照组中较少

这是骨髓细胞经单细胞测序后，得到的聚类图。

这里面分成4个簇，分别是：

单核细胞

循环单核细胞

树突状细胞

和单核树突状细胞

请特别注意一下，这里的树突状细胞

把这些细胞按照有没有p38蛋白的表达进行区分，就会分成这样两个图，

左边是没有p38蛋白表达的，

右边是有p38蛋白表达的。

我们可以看两张图中的树突细胞差别最大，左图中树状细胞较多，而右图中树状细胞要少许多。

这是把前一张图中树突细胞减少的程度做定量的展示，

我们可以看到用蓝色指示的树突细胞，

在有p38蛋白的细胞中，

比没p38蛋白的细胞中，减少的程度

右侧是Log图，进一步显示了树突细胞减少的指数倍数，

细胞外的脂多糖信号，主要是通过Tlr4信号通路传递到细胞内的，

而CD14是Tlr4的共受体。

它们的下游有Myd88的参与。

所以，作者做了这三个基因在各种细胞表达的UMI比较

这里，

左边这张图是用MHC-II与CD11的双荧光来区分细胞，

可以看到，分出了MHC-II蛋白表达量分别为高和中的两部分细胞

右图，是用流式细胞仪对这两部分细胞检测p38蛋白荧光强度的结果

浅灰色的是MHC-II表达水平高的细胞，

深灰色的是MHC-II表达水平为中等的细胞，我们可以看到这两类细胞的P38蛋白荧光强度的分布是有差别的。

这是用脂多糖刺激骨髓来源的细胞，

再用qPCR方法来检测炎症标志基因的mRNA表达水平的变化

我们可以看到，

在MHC-II蛋白水平为中等的细胞中，也就是单核细胞中，

这几个炎症标志性基因，

Tnf、Cxcl2、ll1b，它们的表达都会明显升高,

接下来，我们来说第三部分，用靶向转录因子，对各种细胞进行定性

对于做in vivo活体样本实验的流程，如图所示。

取小动物的新鲜组织做实验，

同时做INs-seq的固定、透化，染色的平行实验

接下来做流式荧光分选，

然后做10x的单细胞处理，以及再做下面的步骤

说一下这里用的这个转基因小鼠模型的特点

这个转基因小鼠是被转了一个Foxp3-RFP基因的小鼠。

其中Foxp3是T调节细胞与其它T细胞的唯一有显著表达差异的基因。

RFP是red fluorescent protein报告基因的缩写，RFP蛋白能发出橙红色荧光。

那么转基因小鼠有了这个Foxp3启动子连着这个RFP基因的重组基因，就可以通过看是否发出橙红色荧光，来判断是否有启动Foxp3基因的表达

用流式细胞仪来看Foxp3基因的表达

左图，是用新鲜的细胞来看，

检测的是RFP报告基因发出的荧光

右图，是用INs-seq固定的细胞，

用针对Foxp3的、带APC荧光基团的抗体，来对细胞中的Foxp3蛋白进行染色

我们可以看到，左右两个图显示出了相似的形状。

这说明：用INs-seq固定加荧光抗体，和用新鲜细胞加报告基因，可以得到相似的结果

作者再把新鲜的单细胞测序结果与INs-seq得到的单细胞测序结果做tSNE图，

左图是混合两组细胞得到的结果

右边两个图，

分别的新鲜细胞得到的图

和INs-seq固定的细胞得到的图

我们可以看到，两者的图型高度相似

这进一步说明了两种方法得到的结果的相似性

这里，

左边是我们在前一张幻灯片展示的图

右图，是用定量的方法展示新鲜与INs-seq两种方法分出的细胞簇

这是新鲜与INs-seq固定两种方法得到的热图。

左边是INs-seq的热图，是939个细胞的结果，细胞数量相对较少，所以显得热图的宽度窄一些

右边是新鲜细胞的热图，是4544个细胞的结果，细胞数量相对较多，所以显得热图的宽度宽一些

可以看到，两个图中的热点基因的位置是大致相同的，这近一步说明了：新鲜与INs-seq固定两种方法得到的表达结果是相似的。

分析表明，

Foxp3阳性的T调节细胞，

会高表达Ctla4、LL2ra基因

以及TNF受体家族的Tnfrsf4和Tnfrsf18基因

作者再把小鼠子宫颈淋巴结中分离出来的T调节细胞的基因表达谱，与之前别人做的肿瘤微环境中的T调节细胞的基因表达谱做比较

看到肿瘤微环境中的T调节细胞中，以下几个基因有高表达

Gzmb、Ccr2和TNF受体家族。

总之，通过针对T调节细胞特异的转录因子Foxp3，在小鼠的子宫颈淋巴结和肿瘤微环境中的差异，证明INs-seq技术可以把转录因子标记和单细RNA测序结合在一起用。

接下来，我们来说第四部分，用INs-seq方法，来定义特定记忆T细胞

POXP3、TCF7、ID2是T调节细胞的重要标记分子

用INs-seq从外周血单核细胞中，分离出如下4组细胞：

CD3+FOXP3+

CD8+TCF+

ID2+

TF7+ID2+

这是用流式细胞仪分选目标细胞的结果之一

这是把上述几种条件分选得到的细胞，

合并得到的tSNE图，

这些是按之前的几个标准分选出的细胞，分别在tSNE图中所处的位置

这是各种分选条件下得到的细胞种类分布图，

左图展示的是每种分选条件下的各种细胞的占比

右图是每种分选条件得到的细胞的数量，与以有CD45蛋白表达的为条件，分选得到的细胞，进行比较后，得到的相对比较结果

总之，我们可以看到INs-seq可以作为一种有效的在单细胞水平上研究各种细胞状态的工具

接下来，我们来说第五部分，Trem2定义两群浸润肿瘤的骨髓抑制细胞

髓样细胞在控制适应性抗肿瘤反应的激活和抑制中起关键作用。

然而，到现在为止，除了两个宽谱系的marker基因CD11b和Gr-1之外，没有清晰的细胞表面分子来定义髓样抑制细胞

作者就是想在其中看精氨酸酶1蛋白，也就是Arg1蛋白，能否作为一个重要的区分作用的基因，来对髓样细胞做区分

图中是实验流程，

用有MCA205这个肿瘤细胞的荷瘤小鼠，作为动物模型，来做实验，看其中的肿瘤微环境。

取肿瘤组织，

进行细胞解离，并做INs-seq固定

然后，用针对Arg1蛋白的荧光抗体做染色

再用流式细胞仪对有荧光和没荧光的细胞做分选

分选后的细胞做单细胞建库测序

这里，左边是流式细胞仪按照有没有Arg1蛋白，对细胞做分选的结果

右边是的对分选出来的细胞，抽提RNA后，用qPCR方法对Arg1基因的mRNA表达量做定量检测的结果。可以看到Arg1蛋白阳性的细胞中，对应的Arg1的mRNA表达量也高，这符合预期的。

作者接着把MCA205小鼠瘤模型中的肿瘤微环境中，通过CD45+ CD11b+ Arg1+ and CD45+ CD11b+ Arg1-挑选出来的8280个细胞的单细胞测序数据，整合成77个元细胞。

来看这77个元细胞的表达水平，如图所示。

横轴是排列的这77个元细胞

纵轴是一些关键基因的表达水平

作者发现，在Arg1+的细胞群中，有一个肿瘤相关的元巨细胞群，这些元细胞高表达Spp1, C1qa, Cx3Cr1, 和Apoe

有一个元调节巨细胞群，这些元细胞高表达Hmox1, Gpnmb, Hilpda, Il7r, 和Clec4d

在不表达Arg1基因的那些细胞群中，有高表达Ly6c2, Plac8, Ccr2

把表达Arg1的元细胞，与不表达Arg1的元细胞，进一步做分析，显示出有基因表达调控共性的图，也就是右边这张图

这个分析进一步确认Pdpn基因和Trem2基因与肿瘤相关巨细胞和调节巨细胞表达Arg1基因明显相关。

在接下来的实验中，会多处提到Pdpn基因

近期关于Trem2基因,有如下的发现

Trem2受体被确立为主要的病理学诱导的髓样细胞信号传导枢纽，可响应组织损伤而激活免疫重塑

Trem2在与神经退行性和代谢性病理相关的髓样细胞中协调免疫抑制、吞噬作用和生存功能

前面的单细胞测序的实验数据，已经证明了，有Ly6C蛋白表达的细胞，它的Arg1的基因表达是低的。

这里，就是有Ly6C蛋白表达的细胞中，Arg1的基因表达水平作为基准1，看几种别的蛋白表达细胞中，Arg1和Trem2这两个基因表达水平。

实验用qPCR的方法来进行。

实验结果很清楚，Gpnmb、Pdpn、Cx3cr1，有这三种蛋白表达的细胞，里面的Arg1基因和Trem2基因的表达水平都明显高于有Ly6C蛋白表达的细胞中的水平

作者做了肿瘤微环境中细胞表达Pdpn蛋白与其它几个标志蛋白的情况，这是用流式细胞仪做的

首先，有检测到同时表达Pdpn蛋白和Ly6C蛋白的细胞

其次表达Pdpn蛋白的细胞，有高表达Cx3cr1蛋白和Gpnmb蛋白

这是用质谱流式细胞技术，来分析肿瘤微环境中几处标志蛋白的表达情况的UMAP图。

图中红色是高表达，蓝色是低表达

可以看到，Pdpn的蛋白高表达的区域，和Ly6C的高表达的区域，正好是相反的

Pdpn和Arg1、Trem2、Cx3cr1的蛋白表达是有一定程度的重合的

总之，INs-seq分析出，有两种完全不同的髓样细胞，

这两种髓样细胞都表达两个蛋白：Arg1和Trem2受体

接下来，我们来说第六部分，Trem2启动T细胞无功能和肿瘤免疫逃脱

为了获得与肿瘤相关的髓样细胞群的更深分子表征，作者对来自MCA205肿瘤的免疫细胞做了MASR-seq测序。把12081个细胞整合成了115个元细胞，

再把这115个元细胞做成了图。

从图中可以看到，表达Arg1的元细胞，和表达Trem2、Pdpn两个基因的元细胞高度相关。

过去的实验提示了Trem2可以在各种病理情况下，促进髓样细胞的增殖、存活和免疫抑制。

接下来，作者就在细胞水平做功能验证。

作者找了N9细胞作为细胞模型，用CRISPR Cas9方法做了敲除Trem2基因的N9的细胞株。

然后，把Trem2基因正常的N9细胞，和Trem2基因缺陷型N9细胞，分别与被alpha-CD3和alpha-CD28激活的、并且用细胞增殖染料标记的有表达CD8蛋白的脾脏幼稚T细胞，以1：5的比例共培养。看细胞的分裂增殖。

图中是实验的结果中CD8 T细胞的增殖情况。荧光光强越淡，则增殖越强

No activation组是阴性对照组，CD8 T细胞很少增殖。

剩下四组都是有用alpha-CD3和alpha-CD28激活刺激，

如果是单纯的激活的结果，可以看到CD8 T细胞增殖很快

TGFb是一个转化生长因子，当培养基中加了TGFb，相对于Activation就有一定的抑制作用

Trem2野生型的N9这组，有和TGFb相似的抑制作用

Trem2缺失型的N9这组，T细胞的分裂就相对于Trem2野生型的多一些，

这个结果提示：Trem2基因有调节髓样细胞的免疫抑制作用

这是刚才5种培养结果中，表达CD8蛋白的T细胞，对它增殖情况的定量分析结果

我们可以看到，Trem2缺失型的N9细胞共培养条件下，T细胞的增殖会多于和Trem2野生型的N9细胞共培养的结果

接着，作者做了Trem2基因缺失的小鼠动物模型，

在Trem2基因野生型和Trem2缺失型的小鼠身上种MCA205肿瘤细胞，看肿瘤的生长情况

图中，我们可以看到野型的小鼠身上，肿瘤的体积

明显大于缺失型的小鼠身上的肿瘤体积，

右图，是肿瘤体积的定量测定结果

Trem2野生型小鼠身上的肿瘤比缺失型小鼠身上肿瘤的体积大，进一步说明了，Trem2基因起到了免疫抑制作用

总结

作者开发了一种命名为INs-seq的分析方法，通过对细胞的固定化、通透化，结合流式细胞仪，检测多细胞的细胞内蛋白表达、和单细胞的RNA-seq信息

通过一系列针对肿瘤微环境的检测，发现Trem2基因可能对髓样细胞有免疫抑制功能

在细胞水平、动物水平，验证了Trem2基因的免疫抑制功能

接下来说一下，我陈巍个人的对这篇文章的一个展望式的观点，

科学家可以考虑把：

INs-seq的细胞固定化、通透化

和带DNA标签链的抗体

10x单细胞测序

结合起来，就可以同时得到单细胞水平的细胞内蛋白表达和单细胞的RNA-seq信息，而且这是一个单细胞的蛋白表达信息和一个单细胞的RNA-seq信息，一一对应的。会很有用处。