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文章的题目是《Multimodel Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma》，发表在2020年7月的Cell杂志上。题目翻译成中文，就是《人鳞状细胞癌成分和空间结构的多模式分析》。

文章的通讯作者，是Paul A. Khavari，他是Stanford大学医学院的皮肤病学教授

文章前半部分的实验方法是

分析10个皮肤鳞癌病人的样本，和对应的正常样本

用单细胞RNA-seq方法对单个细胞的RNA进行分析

用空间转录组方法，对组织的空间表达模式进行分析

用MIBI，也就是多重离子束成像进行分析，也就是对选定的蛋白质做空间表达分析

前半部分单细胞测序、空间转录组分析内容

1.确认一种肿瘤特异的角质形成细胞，Tumor-Specific Keratinocyte ，首字母缩写是TSK，这种细胞位于前沿的纤维血管壁中

2.肿瘤和基质细胞的独特配体受体和空间生态位关联

后半部分：研究对移植到裸鼠身上的肿瘤做CRISPR扫描，具体做法是把肿瘤移植到裸鼠身上通过裸鼠体内生长的肿瘤，做CRISPR扫描，确定亚群必需的致瘤基因网络

2.1，发现TSK细胞亚群

单细胞RNA测序后，经过对正常组织和肿瘤组织的角质形成细胞进行聚类分析，可以发现在肿瘤组织中多出了一种新的细胞类型，

就是图中绿色的这些细胞，文章中把这些细胞命名为“肿瘤特异的角质形成细胞”，英文是Tumor-Specific Keratinocyte，缩写是TSK细胞。

在被检测的病人肿瘤样本中，TSK细胞占比范围从2.7%到13.8%。

再把这些细胞进行表达谱分析，可以清楚地看到肿瘤细胞中的TSK细胞与别的细胞有明显的区别。

TSK这个簇的细胞，有100个基因的表达与其它三个簇的细胞有明显的差异。其中99个基因的表达是明显高于其它三个簇的。

其中，我们可以注意一下MMP10这个基因，这个基因作为TSK的标志基因，在文章后面还会再次提到

从簇与簇的两两比较中，我们可以看到TSK与别的簇的交叉色块的颜色是偏紫的，也就是差异较大

TSK细胞高表达了经典的上皮-间质转化标记基因

上皮-间质转化的英文是epithelial-mesenchymal transition，缩写是EMT

我们可以清楚地看到TSK表达的EMT基因远高于其它三个细胞群

TSK的特征基因与细胞运动和细胞外基质分解相关，

例如：VIM基因、ITGA5基因，这提示TSK细胞有入侵行为

作者发现肿瘤组织中的基底细胞的增殖频率，比正常组织中的基底细胞的增殖频率高5倍。

与之相反的是分化细胞，肿瘤组织与正常组织中的分化细胞，两边没有太多差别。

对2.1部分概括一下，单细胞测序数据表明鳞状细胞癌中的表皮分化层次在关键方面失调：

细胞无法完全参与分化；

基底细胞迅速增殖；

TSK这个亚群的细胞表达出上皮-间质转化（EMT）连锁基因

第2.2部分，谈空间转录组学确定了基于TSK的前沿异质性

为了评估肿瘤细胞群的空间组织，作者对一部分肿瘤的切片进行了空间转录组的分析

从图中，我们可以看到，

粉红色的这些细胞簇，TSK的得分最高，

同时这些细胞也都表达TSK的特征基因MMP10，注意一下这些点分布的位置

我们看左边图中两个样本上描的虚线，这些虚线是肿瘤和正常组织交界的前沿

对应于这些虚线标出来的前沿，在中间的点阵图上，用彩色标示出这些在前沿的点

再来看TSK的点，有多少是属于前沿的点。我们看到第2个病人的样本中，TSK的点90%以上集中在前沿，

而第10个样本中，TSK的点80%集中在前沿。也就是说TSK的点，大部分集中在肿瘤的前沿

左边的三个图，是三个样本中的非TSK的肿瘤前沿的点，

经过分析，可以看到5号样本的这些点中，有高的免疫反应，并且干扰素相关的信号通路中的基因高表达

 2号样本的这些点中，有促进表皮正常发育的基因和促进细胞粘合的基因的高表达

 1号样本中，有促进表皮正常发育基因的高表达

也就是说，在非TSK的点，往往有强的免疫反应、或者有促进细胞正常功能的基因表达

对第2.2部分的概括是

从空间上说，TSK细胞高度集中在肿瘤的前沿

没有TSK细胞的肿瘤前沿，免疫反应强

第2.3部分，谈鳞状细胞癌的免疫状况

这是从单细胞RNA-seq数据得到的跨肿瘤微环境的细胞类型，选择出免疫抑制相关的基因，做的表达小提琴图。肿瘤微环境，就是Tumor micro environment，缩写是TME

从图可以看到，PD-L1和PD-L2仅在迁移的树突细胞中表达，表明引流淋巴结中的树突细胞可能会限制抗PD-1治疗的反应。

这可能也解释了在进行抗PD-1治疗后，新型T细胞克隆浸润到肿瘤中的观察结果。

有趣的是：已知CD276能增加T调节细胞，并抑制T细胞应答，这个基因在肿瘤相关成纤维细胞和TSK上有明显的高表达。

几种抑制T细胞的基因，包括VISTA、LGALS9和TNFRSF14，都在多种细胞中有广泛的表达。

VISTA、LGALS9和TNFRSF14，这几个基因在空间转录组中表现出空间簇特异性模式，与有髓样特异性因子的细胞，共定位在炎症前沿

而这几个基因都有抑制T细胞的作用

耗尽的CD4和CD8 T细胞中都高表达耗尽因子，

如：LAG3、TIGIT、PDCD1、HAVCR2、CTLA4

同时也表达细胞毒性因子，如：GZMA、GZMB、GNLY、PRF1

耗尽的 CD4 T细胞表达滤泡辅助相关分子：ICOS

从图中，我们可以看到，增殖率最高的三组细胞，都是耗尽细胞

接下来，通过分析单细胞RNA-seq中的趋化因子和受体表达，评估肿瘤浸润淋巴细胞的潜在募集机制。

几个趋化因子受体在重叠的T细胞亚群中高度表达，

例如：CXCR3、CXCR6、CXCR4，表明这些细胞共同招募趋化因子，并且与空间转录组中的共定位一致。

 T调节细胞特异地表达CCR8，这提示，CCR8可能是抑制T调节细胞的召募作用的潜在治疗靶标

对第2.3部分做一下概括

多种细胞参与了免疫抑制作用，包括：

耗尽的T细胞

T调节细胞的召募作用

与抑制信号共定位的树突细胞

第2.4部分，我们谈一下炎性肿瘤微环境的单细胞空间架构

为了以单细胞分辨率解析肿瘤微环境的空间组织，作者在6个患者的肿瘤前缘的18个视野（FOV）中进行了多重离子束成像。

这里说一下多重离子束成像技术。

简单来说，它就是空间蛋白组。

它的基本原理和传统的免疫组织化学相近，只是用金属同位素标记的抗体来代替了萤光染料标记的抗体，用逐点的等离子体质谱扫描代替了显微镜拍照。

先是和传统方法一样，制作切片

接着用重金属离子同位素来标记抗体，每一种抗体用一种同位素标记，一次最多可以有100种金属同位素，也就对应于100种抗体，最终对应到100种蛋白。

然后把这些抗体和样本切片进行反应，也就是相当于传统免疫组织化学中荧光抗体对切片的染色，差别在于这里用的抗体是用金属同位素进行标记的，而不是用荧光染料进行标记的。

再对切片逐点地用激光照射气化，对蒸气进行等离子化，再做质谱分析。

质谱可以一次测量100种金属同位素。再从同位素的含量回推到被照射的点上的蛋白含量，

再进一步结合每个点的空间坐标信息，回推到切片空间上的蛋白含量。

分析结果发现，尽管区域异质性很大，但是CD8 T细胞、T调节细胞、巨噬细胞、和CD4 T细胞高度相关

其中CD8 T细胞和T调节细胞相关性特别高，r值约0.72

CD8 T细胞和T调节细胞有明显的共定位现象，

图中，是多重离子束成像的四个视野中CD8 T细胞与T调节细胞的距离，

黄颜色的峰表示的是各个亚群细胞相互的随机距离，

灰色的峰是CD8 T细胞和T调节细胞距离的分布，

可以看到，有3个视野的灰色的峰是明显偏向短距离的，而且FDR也小于0.05，这说明CD8 T细胞和T调节细胞的距离的比随机距离明显要短。

左边的图展示的是肿瘤与基质的交界的情况

右边的图显示成纤维细胞，巨噬细胞和T调节细胞在肿瘤-基质边界处最丰富，而CD8 T细胞和嗜中性粒细胞在很大程度上被排除在肿瘤之外，这表明T调节细胞的定位可能会阻止效应淋巴细胞进入肿瘤

对第2.4部分进行概括

空间定位分析：

发现CD8 T细胞与T调节细胞高度共定位

在肿瘤与基质的交界处，T调节细胞、成纤维细胞、巨噬细胞有富集

边界处的T调节细胞可能阻止淋巴细胞进行入肿瘤

第2.5部分，在前沿边缘映射细胞的信息交互

将单细胞RNA-seq和空间转录组的数据集进行整合，寻找前沿的相邻肿瘤与TME细胞之间的信号传导的特点

把分化细胞、基底细胞、TSK细胞分别作为信号发出与接收者来做分析

上图是这三种细胞作为信号的发出者

下图是这三种细胞作为信号的接收者

作为信号发出者

可以发现肿瘤相关成纤维细胞与TSK配体有配对介导关系，如：MMP9对LRP1，TNC对SDC1

另外TSK可以通过配体-受体对来调节内皮细胞，如：PGF对FLT1，PGF对NRP2，EFNB1对EPHB8

作为信号接收者

内皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞显著共表达NicheNet预测的配体，例如TFPI，FN1和THBS1，与TSK受体匹配

有广泛地表达TGFB1和TGFB3，进一步支持TSK成为一种类上皮-间质转化的细胞群

在一项PD-1检查点抑制剂治疗两种类型鳞状细胞癌的临床试验中，TSK 特异性基因ITGB1和PLAU高表达与进展生存期显著降低有关

这提示了TSK高表达的基因，可能是未来肿瘤治疗的靶基因

对第2.5部分进行概括

分化细胞、基底细胞、TSK细胞分别作为信号发出与接收者，参与肿瘤前沿边缘的信息调节网络

这部分的工作还提示，针对TSK细胞亚群进行治疗，可能会改善免疫治疗的效果。当然这还需要更多的工作来进一步了解

第2.6部分，对移植到裸鼠身上的肿瘤做体内CRISPR扫描

把肿瘤移植到裸鼠身上做成移植瘤，分两个方向

左边是把肿瘤细胞移植到裸鼠身上，成瘤后做单细胞测序

右边是把肿瘤用sgRNA库进行转染后，发生CRISPR基因剪辑，再移植到裸鼠身上，然后再取出裸鼠身上的肿瘤组织进行高通量测序

图中是两个移植瘤经过单细胞测序后，得到的细胞分簇的UMAP图

基底细胞、循环细胞、分化细胞、TSK细胞，四种细胞都有

这是把CAL27这个样本，分别进行体外培养，和体内培养，然后测序得到的差异。

测序得到了四种细胞标志性基因表达量，图中黑色的条子是体内培养的结果，红色的条子是体外培养的结果。

可以看到：基地细胞、循环细胞和TSK细胞的体外得分比体内得分高，而分化细胞的体内得分高。

作者推测，这是因为在体外培养过程中，基底细胞、循环细胞和TSK细胞对微环境的依赖小，所以生长得快。而分化细胞对微环境的依赖大，离开机体后，生长得慢。

接下来，作者对三个移植到裸鼠身上的鳞状细胞癌，做了CRISPR扫描。

扫描中，发现了肿瘤周期角质形成细胞的以PCNA和GINS2为中心的最大网络

通过CRISPR扫描发现TSK细胞中的专用网络，

包括ITGB1，FERMT1，CD151，ARPC2和HSP90B1等基因。

其中ITFGB1、CD151和FERMT1的蛋白产物在细胞表面发生相互作用以介导整联蛋白信号传导

对2.6部分进行概括

经过CRISPR扫描，发现：

肿瘤周期角质形成细胞的以PCNA和GINS2为中心的最大网络

TSK细胞中有专用网络，包括：ITGB1，FERMT1，CD151，ARPC2和HSP90B1等基因

作者使用单细胞RNA-seq对鳞状细胞癌构建了细胞亚群的单细胞转录组图谱，并用空间转录组和多重离子束扫描进行了整合的空间分析，以评估这些细胞所处的生态位。

在肿瘤细胞中鉴定出一个细胞亚群，TSK,肿瘤特异性角质形成细胞亚群

免疫前缘，富集有TSK细胞、T调节细胞、耗尽T细胞

同时有大量的抑制免疫反应的基因进行表达

这提示了可以针对这些抑制免疫反应的基因进行肿瘤靶向治疗

通过对移植瘤做CRISPR基因扫描，发现了：

肿瘤周期角质形成细胞的以PCNA和GINS2为中心的最大网络

TSK细胞中的专用网络，包括ITGB1，FERMT1，CD151，ARPC2和HSP90B1等基因