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首先，spaceranger将前面产生的fastq测序数据比对到参考基因组上，进行基因表达的定量，即UMI计数。

接着，依靠图像处理算法确定组织位置，即spots定量。这样就可以得到一个spots和基因的表达矩阵。

最后，基于这个表达矩阵，进行下一步降维，聚类及差异分析。

好，我们先看如何实现基因的定量。

主要分为四步：

第一步基因组比对，采用star将reads比对到参考基因组上，根据比对位置对reads进行分类：分为外显子区，内含子区及基因间隔区。

第二步MAPQ调整：对于有些reads同时比对到外显子区及其它区域，则优先认为比对到外显子；若该reads在外显子区域的MAPQ为255，则更可信

第四步UMI计数：主要有两个校正过程(1)对UMI碱基进行校正：主要校正UMI中的测序错误(2)对基因进行校正：保留多数reads支持的基因注释

Space Ranger 如何识别组织区域？

主要解决两个关键问题：一是基准点对齐，二是确定组织位置；

图中红色点就是基准点，这些基准点组成一个基准框，基准框的角和边都是独特的，左上角是沙漏型，右上角是实心六边形；右下角是空心六边形，左下角是三角形。

首先提取“看起来”像基准点的spots，将这些候选基准点与已知的基准点模式对齐，识别出基准线独特的角和边，坐标转换，将spatial barcode与组织图像联系起来。

接着，计算和比较组织切片放置的多个估计值，这些估计值用于训练分类器，将捕获区域内的每个像素标记为组织还是背景。这样就可以识别出组织区域。

spatial barcode在切片中的空间位置信息是怎么表示的呢？

它们是有坐标信息的。

我将上面那张图片截取了左上角部分进行放大，捕获区域内spots总共有78行，第一行spots的行坐标从数字0开始标记到最后一行77；列是交叉排列的，偶数行，第一个spots列坐标标记为0，依次为2，4，6一直到126；对于奇数行，第一个spot空出半格，从列坐标从1开始标记，依次为3，5，7一直到127，相当于每行64列，因此共计78*64=4992 spots。

也就是说每个捕获区域最多捕获4992个spots。拿两个spots举例说明一下：行坐标是4，偶数行，第一个spot的列坐标0，2，4，这个spot的坐标为4，4这个spot行坐标是5，奇数行，第一个spot的列坐标从1开始，1，3，5，7，坐标信息就是5，7。这个坐标信息就代表spatial barcode在切片中的空间位置。

经过基因组比对，识别组织区域，可以得到spots和基因的一个表达矩阵。基于表达矩阵，进行下一步降维，聚类及差异分析。降维过程中有一个非常重要的参数就是主成分个数。这个参数对后续spots聚类影响非常大的。这里space ranger 默认为10.

space ranger主要有四个命令：

1.mkfastq实现的功能将测序产生的bcl格式数据转换成fastq格式

2.mkgtf/mkref用于构建参考基因组索引文件

3.有了原始fastq测序数据及参考基因组索引文件，可以用count命令对单样本进行spot和基因进行定量，定量结果储存在features，barcodes和matrix三个文件里。

4.mat2csv进行格式转换，将spot和基因进行定量转换为一个行为基因列为barcode的表达矩阵，csv格式。

另外，还有testrun:测试软件是否安装成功；upload：上传日志文件；sitecheck：查看配置，输出系统信息

我们先看一下space ranger下载及安装，spaceranger对内存要求比较高，最好128G。直接去官网下载，解压即可；对于人和小鼠参考基因组可从官网下载

mkfastq命令实现功能是将测序议产生的bcl格式转换为fastq格式，生成三类fastq压缩文件R1,R2,I1;R1read1端测序数据，R2reads2短测序数据，I储存sample index 信息；操作命令非常简单，就一条命令，里面有一个参数非常重要--use-bases-mask=Y28,I8,Y151，行命令的意思就是Reads1截取28bp,reads2截取151bp，sample index序列截取8bp，为什么这么做呢，我们看一下构建好的文库结果，这是reads1测序起始点，测到的是spatial barcode， UMI，poly(T)序列，只有前28bp才是有用信息。这是reads2测序的起始位点，因此只有reads2测到的是转录本序列

spaceranger mkgtf/ref ：构建参考基因组索引文件；人和小鼠参考基因组可从官网下载，其它物种从Ensemble，UCSC等数据库下载fasta基因组文件和gtf注释文件

mkgtf实现的功能只过滤GTF文件，只保留感兴趣的基因注释 (gtf第三列特征类型必须有exon)；mkref---输入FASTA 和过滤后的GTF文件构建索引；如果基因组文件比较大，mkref这个过程可能需要几个小时时间。

spaceranger count:实现的功能是spots和基因定量，输入是mkfastq得到的fastq文件及组织切片的图像，输出结果是一个outs目录，里面储存spots gene的定量结果及初步的降维聚类结果，后面会详细解读。

这张芯片最上面有个serial  number ，这是每个visium波片上印刷的唯一标识符，四个捕获区域，从上倒下一次标记为A1,B1,C1,D1；如果space ranger无法自动识别出组织区域，需要manual alignment导出json文件，人工识别组织区域。这里特别提示以下：space ranger count命令对fastq测序数据命名要求非常严格。

spaceranger mat2csv实现的功能进行格式转换

目前，spaceranger 还未发布多个空转样本合并分析命令；但可以用cellranger aggr合并spotsXgene表达矩阵。特别注意：barcodeID后面数字与cellranger aggr输入aggr.csv文件顺序是一致的

TAAGAGATCACCTTAT-1：细胞ID加后缀-1表示Sample1

GGCACTAGACTACAA-2：细胞ID加后缀-2表示Sample2

模板来自于http://meihua.docer.com/

10Xgenomics公司选取了人和小鼠五个数据集，read2的长度分别设置为75，91，120bp，分别统计每个数据集的比对率，绘制折线图。从图中可以看出read2设置91bp时，比对率最高；按同样的方法统计每个spot检测的基因个数中位数。同样在read291bp时，每个spot检测的基因个数中位数最高，这是因为测序过程中，随着试剂的消耗，reads测序末端质量偏低，引入碱基错误，同样reads2设置不能过短，reads可以比对到基因组多个位置，表面上比对率提高，但是mulit-mapped reads在UMI计数时也会过滤掉，造成资源浪费

space ranger识别组织区域时，主要依靠基准点对齐，基准筐四个角的形状是固定的，输入的图片必须保证方向是正确的，即左上角是沙漏型，右上角是实心六边形；右下角是空心六边形，左下角是三角形。如果方向不对，用ps调整一下即可

捕获区域的左侧或右侧有大量空白，或者含有其它样本捕获区域的一部分，可能会导致基准对准或组织检测结果不符。建议裁剪图像以去除基准边界外的区域。

space ranger识别组织区域时，主要依靠四个点，如果这四个点被组织区域覆盖掉，那么space ranger可能无法识别出组织区域。左图左下角这个角肉眼无法识别出，这种情况下一般space ranger也识别不出来。但像右边这种情况，四个角虽然被被组织区域覆盖掉，肉眼基本可以识别出，space ranger也可以识别出来。一旦遇到组织区域无法识别时，就可以通过loupe browser进行图片manual alignment

由于基准点在边缘处稍暗，因此曝光过度的基准点将显示为环而不是实心圆。通常，采集后无法校正曝光差的图像

如何进行manual alignment?

生成的json文件如何传递给count命令？

space ranger count命令输出结果保存在一个outs目录下，文件非常多。为了方便查看结果，提供了一个所有结果汇总的html页面，即web_summary.html。spatial目录储存着spatial barcode 空间位置信息；filtered_freature_bc_matrix储存着spotXgene定量结果；analysis目录储存着数据降维，聚类及差异分析结果；cloupe.cloupe用于可视化，可以用loupe browser打开，查看基因的表达，辅助鉴定细胞类型，创建和修改子群，差异分析等操作。这里呢重点介绍三个文件：web_summary,html，spatial目录和filter_feature_bc_matrix目录。

web_summary.html的结果分成了summary和analysis两部分，summary主要是一些描述信息，比如识别出来的组织区域spots数，检测到的基因数目，测序质量，reads比对情况等信息。我们分别详细介绍一下。

第一部分是spots＆基因数目的评估结果，样本2总共检测到2698个被组织覆盖的spots，每个spot平均测序reads为115K左右，每个spot检测到的基因中位数是5861；

第二部分指标反应的是碱基测序质量的信息，一般情况下，基本上不会发生测序质量问题

第三部分描述是识别出来的组织区域及spots详细信息，图中红色框就是基准框，捕获区域内蓝色区域即是自动识别出来的组织区域。

第四部分是reads比对情况，比对率一般不会低于70%，如果比对率过低，考虑参考基因组物种不对或者样品污染；

第五部分是样本信息，ID，试剂型号，slide编号，参考基因组及软件版本号等

我们继续看analysis部分：聚类结果通过绘制二维的TSNE布图进行结果展示，图中每个点表示一个spot。上面这张图颜色的深浅表示检测到的UMI数量高低，颜色越深检测到UMI越高。下面这张图则是用不同的颜色代表不同的cluster；左边的图组织切片空间位置分布图，同理，上图颜色的深浅表示对应位置检测到的UMI数量高低，下图不同的颜色表示不同的cluster。这样的话，将spatia barcode对应的空间位置与基因表达量，聚类结果相关联起来。

对reads进行随机抽样，观察不同测序数据量情况下的测序饱和度分布，并绘制曲线。如果曲线末端区域平滑，说明测序接近饱和，再增加测序量，测序饱和度也不会提高太多

filtered_feature_bc_matrix目录包括barcodes.tsv.gz，features.tsv.gz，matrix.mtx.gz三个文件。barcodes里面储存spatial barcode ID，features文件储存检测到的基因id和symbol。matrix.mtx.gz是关于基因，Spot表达矩阵。第一行三个数字分别表示这个样本检测到了基因，spots和UMI总数。从第二行开始，第一列表示基因序号，二列表示spot序号，第三列表示检测到UMI数目。举例说一下，33509 1 53表示在features文件里第33509那个基因在第一个spot检测到的UMI数目是53。第一个spot对应的就是features文件第一个spatial barcode ID。

spatial 目录里面有个文件叫tissue_positions_lists.csv，里面存着每个spatial barcode ID的空间位置信息，总共六列。

第一列：spatial barcode ID；第二列：是否覆盖组织区域；第三列：行坐标；第四列：列坐标；第五列：每个spot中心列像素坐标；第六列：每个spot中心行像素坐标；

有了这些位置信息，我们就可以将spatial barcodes分析结果与它在组织中的空间位置联系起来。

讲到这里，大家对space ranger这款软件基本上有了一个认识。操作非常简单，就一条命令，但是大家需要掌握的知识点还是蛮多的：比如样本的命名，R1-length，R2-length长度设置，怎么从web_summary.html结果判定测序数据质量的好坏，是否需要补测数据等等。

这节课我主要从原理，主要命令，重要参数及结果解读等四个方面详细介绍spcae ranger这款软件，通过这节课，大家可以知道spaceranger count 主要的功能是spotXgene定量，将spatial barcode在切片组织中空间位置进行可视化，并基于表达矩阵进行一个粗略的降维和聚类。

如果需要进一步分析官方推荐使用 R 包Seurat。