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上课笔记|多模式相交分析应用于原发性胰腺肿瘤
发布日期：2020-07-17浏览：
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美国纽约大学Itai Yanai团队利用基于微阵列的空间转录组学和单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示了胰腺导管腺癌的组织结构。作者将多模式相交分析应用于原发性胰腺肿瘤，发现导管细胞，巨噬细胞，树突状细胞和癌细胞的亚群具有空间受限的富集，以及与其他细胞类型的独特共富集。2020年1月13日，《自然—生物技术》杂志在线发表了这项成果。
在dafabet手机黄金版特邀名师讲堂第四节直播课中，陈巍老师和大家一起对这篇文章进行了解读。
为方便大家学习，小编把PPT内容整理出来啦！
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今天要讲解的文章的题目是：Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas
翻成中文，就是《基于微阵列的空间转录组学和单细胞RNA-seq的整合揭示了胰腺导管腺癌的组织结构》
这篇文章的通讯作者，是Itai Yanai教授，他是纽约大学计算医学研究所的主任，同时也是纽约大学生物化学与分子病理学系的教授。
PART.01
文章框架
拿2个胰腺导管腺癌的样本，做实验。
分别对这2个样本做10x单细胞测序和空间转录组测序。
把两种实验做好之后，先做单独的数据分析，
再把数据整合在一起做交叉分析
PART.02
10x单细胞测序的分析结果
这是两个样本的10x单细胞测序的t-SNE图，每个细胞大约得到2500~3300个UMI，归并之后每个细胞大约有1400~1700个表达的基因。
通过递归层次聚类分析，发现A样本含有15个细胞簇，B样本有11个细胞簇。
把A、B两个样本的各个细胞簇对应起来看
纵轴是A样本的细胞簇，
横轴是B样本的细胞簇
颜色越偏红，则对应的一致性越高
我们可以看到斜对角的这条对角线上的格子是很红的，表示两个样本的对应簇的对应一致性很高
接下来分析两个样本当中的拷贝数变异，
在样本A当中发现两个簇的细胞有拷贝数变异，在样本B当中有一个簇的细胞有拷贝数变异。
这里关注两个基因，TM4SF1基因，和S100A4基因，接下来，我们会分别简称T基因、和S基因。
在样本A当中，上面这部分的细胞是在3号染色体有严重的拷贝数增加，在4号染色体有拷贝数减少，而且这部分细胞高表达T基因，但这些细胞不表达S基因。
下面这部分细胞，有6号染色体的拷贝数减少，这些细胞高表达S基因，但不表达T基因
B样本当中的这个簇有6号染色体的拷贝数减少和7号染色体的拷贝数增加。而且这个簇的细胞都高表达T基因
这两个样本当中出现的6号染色体拷贝数减少，和7号染色体的拷贝数增加，与传统已知的胰腺导管腺癌中常出现的拷贝数变异是一致的。
作者对A样本同一来源的FFPE样本做了T蛋白和S蛋白的双荧光染色，可以看到红色的T蛋白，和绿色的S蛋白出现在不同的地方，
这和前面单细胞测序的结论，就是表达T基因的细胞，和表达S基因的细胞，是两个不同的簇的结论，是一致的。
在样本B中，用KRT19与T蛋白做双荧光染色，这两个蛋白共同出现，我们可以看到红色和绿色的光斑紧挨着
KRT19蛋白是恶性肿瘤细胞的一个标志性蛋白，接下来我们会将之简称为K蛋白
这和前面B样本单细胞测序中发现的结论，就是这个簇中有基因拷贝数变异的细胞有T蛋白的高表达，而且估计这些细胞是肿瘤细胞的结论，是一致的
再在样本B中，对K蛋白和S蛋白做双染色，我们可以看到，K蛋白的红色光斑很明显，但S蛋白的绿色光斑就要少很多
PART.03
空间转录组测序的分析结果
切片组织学注释，把A样本的切片分成了四种组织
作者拿到空间转录组的数据，就对空间转录组的Spot进行聚类，A样本的spot是被聚成了4簇，
我们来看切片组织学注释的区域，和空间转录组spot聚成的簇的对应关系
两者，都指出右上角这一块是肿瘤，
左边这一块，被确认是导管上皮细胞
其它两类组织，也对应得很好
这是样本B的切片图与空间转录组图的对应
肿瘤组织对应得很好，
导管上皮细胞也对应得很好
剩下的间质，也对应得很好
在这张幻灯片中，左边是样本A的空间转录组的聚类分析图，右边是主成份分析中的第一个主成份的分布图，
空间转录组的肿瘤部分，对应于主成份分析的低分部分，对应得很好
胰脏组织，对应于高分部分，对应得很好
其它两个区域也对应得上
我们可以看到，左右两张图的对应关系很好
样本B，肿瘤部分，对应于低分部分
导管上皮细胞，对应于高分部分
中等分值的是间质部分
这里说明一下，样本B中没有胰腺部分，所以导管上皮细胞就成了相对的高分区域
PART.04
多模式交叉分析的结果
这里的多模式，就是指空间转录组，和10x单细胞转录组，这两种模式。
空间转录组的优势是可以从空间上把区域中的基因表达特征找出来，10x单细胞的优势是从细胞种类上把基因特征找出来，
那多模式交叉分析，就是把这两者的优势结合起来，来看基因的表达。
人类有2万多个基因，
单细胞测序分析出：成纤维细胞当中高表达555个基因，
空间转录组分析出：肿瘤区域高表达660个基因，
这两个部分有58个基因是重合的，
这种重合，它的P值是很显著的，P值达到了10的负15次方的级别，也就是说这种重合是一个很引人瞩目的事件。
也就是经过交叉分析得出，样本A当中，用单细胞测序分出来的成纤维细胞的高表达的基因，与用空间转录组分出来的肿瘤区域的高表达基因，两者的重合度极高。
再把A样本当中的基因表达按细胞种类在纵向展开，按区域在横向展开
我们看到A样本中的两种肿瘤细胞，与成纤维细胞，都是在肿瘤区域形成富集
样本A和样本B中，都有导管细胞，作者把这两个样本中的导管细胞数据拿出来，再做进一步的细分
这是对两个样本中的导管细胞进行再细分的结果。
上面是两个样本再细分后得到的t-SNE图，
样本A的导管细胞，是被分成了4个亚群，
样本B的是被分成了3个亚群，相比于样本A，少了一个APOL1高表达的亚群
下面的这8张图是各个亚群的各自代表基因在t-SNE图中的表达情况
在A样本的CA9高表达的导管细胞中，同时有APOL1、低氧相关基因的高表达。
有意思的是，这些APOL1高表达的导管细胞，因为是导管细胞，所以正常情况下是应该出现在导管部位，而作者发现这个亚群的细胞却主要出现在癌症组织中
这是对样本A做K蛋白和CA9的双荧光染色的结果
图中红色的K蛋白是肿瘤区域特征性表达的基因，在相同的位置有绿色的CA9基因的表达，
把红绿两种荧光颜色的图谱合并，我们可以看到K蛋白和CA9是混在一起表达的，这里黄绿色的光就是红色光和绿色光混合发出的光
导管细胞出现在不属于导管的癌症组织中，这是一个有意思的现象。
并且这群细胞还表达低氧蛋白，这是另外一个有意思的事情，因为肿瘤组织往往因为代谢快，消耗大量氧气，同时血管又不够多，导致组织中氧含量低，所以说这是一个有意思的事情
在抗原呈递基因HLA-DRB5高表达的这个导管细胞亚群中，表达许多与抗原呈递相关的基因，也就HLA字母打头的这些基因
这又是一个有意思的事，因为正常情况下，抗原呈递是专职的免疫细胞做的事，现在发现导管细胞也同时兼职地表达抗原呈递的基因，或许导管细胞也在兼职地做抗原呈递的工作。
作者接着对A样本做了K蛋白和HLA-DR的双荧光染色，
红色的是K蛋白，绿色的是抗原呈递基因的代表HLA-DR，
把两者合并，黄绿色的光就是两者混合发出的光
我们在这里可以看到HLA-DR基因与K基因在几乎相同的位置表达，也就是说在有肿瘤细胞的位置，导管细胞也在参与对肿瘤的抗原识别工作
把A样本中的导管细胞亚群，再拿来做更细的多模交叉分析。
横向排开的，是4个空间区域的高表达基因
纵向排列的，是从导管细胞分出来的4个亚群
颜色越偏棕色，就是富集程度越高
比较特别的是这一块，因为它是导管细胞的一亚群，所以，按常理来说，应该是导管上皮细胞这一块富集程度高，也就是这块的颜色理论上应该更偏棕色，但我们看到实际情况是它在癌组织区域有富集，这与我们之前观察到的，APOL1高表达的导管细胞出现在癌组织区域的情况，是一致的。
PART.05
肿瘤微环境中细胞关系
作者接着对肿瘤细胞的微环境做了分析
我们就来说这个微环境分析的结果。
作者根据过往的论文，挑了三组基因作为细胞微环境的指标。
这三组指标分别是：
低氧压
氧化磷酸化
压力反应
其中压力反应是作者真正关心的，其它两组指标是作为参考的
先在样本A的癌症组织中，检测压力响应基因的表达量，区分出高表达量和低表达量的spot
把表达量不同的spot分成两组，高表达组，和低表达组
把高表达量组中的前500个高表达基因找出来
把这组500个高表达基因，与83个炎性成纤维细胞基因进行比较，发现有7个基因是重合的，P值是千分之1.2，显著性是很高的
作者接着又加测了一系列的样本，包括患者A的另两个组织块，患者B的3个组织块，还有另外4个患者的各一个组织块
结果如图所示，我们可以很明显地看到排在第一行的炎性成纤维细胞，颜色最深，富集程度最高、最明显。
另外，我们也可以看到在单核细胞和T细胞/自然杀伤细胞中有一定程度的富集，但在这两种细胞中的富集程度都不如在炎性成纤维细胞中的富集程度高
在确认了炎性成纤维细胞与癌症组织的压力响应之间有关联之后，作者又找了TCGA数据库的183个样本的数据进行验证。TCGA是一个公开的肿瘤基因数据库（The Cancer Genome Atlas ）。
验证的结果如图所示，我们可以看到炎性成纤维细胞的压力响应相关的模块是有很强的相关性的。
相关系数R是达到0.47，
显著性P值是达到10的负11次方的水平，显著性很高
而低氧和氧化磷酸化的两个模块，相关性没有那么强。
为了进一步验证炎性成纤维细胞与癌症组织的关系，作者又对样本中白细胞介素6和K蛋白做双色荧光染色。
K蛋白的红色荧光显示出了癌细胞在的位置，图中的白色箭头标注了癌细胞
黄色荧光是白细胞介素6，白细胞介素6是一个重要的炎症因子。
把红、黄两色的荧光合并，是这样的结果，可以看到在肿瘤细胞出现的地方，往往有白细胞介素6的出现。
这样，就和之前说到的“炎性成纤维细胞与癌组织在空间上紧密相连”这个论点一致起来了。
PART.06
总结
作者通过10x单细胞测序，和空间转录组测序，做多模式交叉分析，并且进一步做肿瘤微环境中的细胞关系，得到了一系列有意义的科研结论，例如：
炎性成纤维细胞与癌细胞在空间上是紧密相连的。
