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上课笔记|从全器官尺度绘制人类心脏发育的单细胞基因表达时空图谱
发布日期：2020-07-03浏览：
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dafabet手机黄金版特邀名师讲堂第三课，由《陈巍学基因》创始人——陈巍老师继续为我们解读空间转录组应用文献：《A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart》。
以胎龄分别为4.5周、6.5周、9周的人类胚胎心脏样本为研究对象，综合利用单细胞转录组测序、空间转录组测序和RNA原位杂交等实验技术及细胞空间概率分型的计算方法，首次从全器官尺度绘制了人类心脏发育的单细胞基因表达时空图谱。
为方便大家学习，小编把PPT整理出来啦。
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今天要讲解的文章的题目是：A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart
翻成中文，就是《人心脏发育的时空器官全基因表达和细胞图谱》
这篇文章的通讯作者，是Joakim Lundeberg，他是瑞典斯德哥尔摩KTH皇家技术学院的教授。同时，他也是spatial transcriptome技术的发明人。后来，他把这项技术卖给了10x公司，10x公司把这项技术升级成了现在visium技术。
NO.1
文章思路
文章的思路是：拿人的胚胎的心脏，做三组实验，空间转录组、10x单细胞测序、原位测序。
这三组实验做好之后，把数据整合在一起得到时空图。
NO.2
实验与分析
取了3个人类心脏样本做成切片 ，做空间转录组
4.5~5周胎龄的，切成4片
6.5周胎龄的，切成9片，
9周胎龄的，切成6片，
三个样本一共切19片
先做了一个免疫组化，看一下人胚胎心脏在这三个发育时期的情况。
图中是三种染色，DAPI染色是蓝色的，它是起到一个衬底的作用，
接着做了两个蛋白的染色，染成绿色蛋白的是TNNT2蛋白，这个蛋白的全名叫“troponin T ”，中文叫“肌钙蛋白T”，发现这个蛋白主要在左右心室心房表达。
第二个被染色的蛋白是ACTA2，是染的红色，这个蛋白全名叫“aortic smooth muscle actin”，中文叫“主动脉平滑肌肌动蛋白”，也就是白色虚线标的这个区域，它主要是在流出道表达，心脏的流出道主要就是指主动脉和肺动脉。
橘色虚线包括的含有肺静脉的纵膈组织，只有在6.5孕周和9孕周的样本能够看到，4.5孕周的样本中看不到。
接着对19张切片做了空间转录组，得到了3115个spot，对这些spot做降维聚类分析，
得到10个簇，也就是10个cluster，这10个cluster代表了10个不同的解剖区域，
例如：0号簇是“紧凑型心室心肌”, 1号簇是“小梁型心室心肌”,
接着再把这些spot点映射到切片上去，
可以看到从第0号到4号簇，也就是蓝绿色的这些簇，都是心肌细胞。而且可以看到spot的数量随孕周的增大而增加，这也反映了心脏的生长 。
接着对这10个簇做了差异基因的分析，找到每个簇的差异基因。
向上是表达上调，向下是表达下调，红颜色的点是差异显著性超过0.01的点。
接着对每个簇中有上调的差异基因做GO富集，
第0、1、2、3、4簇都富集有心肌收缩的功能和心脏发育的功能
而第0簇与第1、2、3、4簇的区别在于，第0簇在代谢方面有富集
第1簇、第2簇在传导功能有富集
第3簇在氧化代谢方面有富集
还有许多这样的特征特点，我们就不在此一一列举了。
作者另外取了一个6.5孕周的心脏，
把这个心脏横切了一刀，分成上下两半，分别做10x单细胞测序。
这样分两半做测序，目的在于可以更好的区分细胞是来自于心脏的哪个部分。
测序完成后，共得到3717个高质量的单细胞，接下来把上下两半的细胞合并起来做一个聚类分析。
结果是得到15个簇，这15个簇分别代表了不同的细胞类型，
例如第0簇是毛细血管内皮细胞，
第1个簇是心室心肌细胞等
接下来做原位测序。
原位测序的基本原理如图所示，后面我们还会详细说。
这里，作者选了69个基因作为目标基因做了一个panel，做原位测序。
这是原位测序得到的整个的图，
取当中的一小部分放大来看，就是这样的，
再在其中取更小的一部分，再放大来看，就是这样
这里，灰色的背景就是DAPI的染色，DAPI的染色也说明这里有一个细胞。
从这个中心点放射出来的许多个各种颜色小符号，圆圈、五角星、三角形，就表示这里检测到的mRNA所对应的基因
再看接下来的几个例子，
第二个例子，77.8%是心外膜来源的细胞。虽然这个细胞当中还有一些其它的基因，但是因为大头还是心外膜来源的细胞的基因，所以就把这个细胞定为“心外膜来源的细胞”
其它的例子也是同样道理，我们就不一一列举了。
把整张图中每一个细胞属于哪个簇都分清楚，我们就得到了这张切片的完整的细胞种类图
把多张细胞种类图在心脏的三维模型当中进行叠加，就得到了整个心脏细胞种类的三维图。
把所有切片的转录组的spot图都叠加到心脏的三维模型上，就得到了心脏的三维转录组空间图。
最左边的这张图是正视图
中间的是侧视图
最右边这张是顶视图
有了几个不同时期的心脏转录组空间图，整个心脏发育的时空图就完成了。
NO.3
原位测序
我们说一下原位测序的优缺点。
原位测序的优点是分辨率很高，可以达到1微米的空间分辨率的水平。
但原位测序也有限制条件，就是要专门制备特定的挂锁探针panel，而且一个实验当中，探针种类的上限是100个，也就是说一次实验中能够检测的基因数量不超过100个。
NO.4
高分辨空间转录组
高分辨空间转录组，可以理解成是把illumina的生物芯片技术，与空间转录组技术的结合。
这是一张标准的illumina的生物芯片。
把其中一小块放大，就看这一小块是由许多蜂窝状排列的六角型的块块组成的，
再把其中一个块放大，可以看到每个蜂窝小块里又以蜂窝状排列了许多的小孔。
这些小孔中，每一个被加载了一个小微珠。
每个小微珠上，都已经事先连好了几万根DNA单链。而且每一个小微珠所带有的DNA单链的序列，都是特异的。
这根DNA单链上的序列，大体上就是illumina测序文库接头的序列
但这其中有一段spatial barcode，有特别重要的意义。每一个微珠上，它的spatial barcode序列都是特别的，用来对微珠做空间座标定位用。后面我们还要再解释
有了这样的芯片之后，，
就把样本切片放在芯片上，
逆转录，再做成测序文库。这个和visium空间转录组的做法是一样的。
这个实验的分辨率高达2个微米，就是因为芯片的点阵很密集，
点与点之间的距离是2微米，这样就可以得到分辨率很高的分析结果
Illumina的这个生物芯片的制备方法，是在硅片上，
用光刻的办法蚀刻出许多个小孔，
然后把混合好的微珠撒到到小孔中。
也就是说，每个小孔中会落入哪种序列的微珠，事先是不知道的。
要搞清每个小孔中落入的是哪种微珠，是要通过特别的座标定位过程来定位的。
这个就是座标定位的原理图，所谓座标定位也就是搞清楚每个小孔中的微珠上的spatial barcode的序列
要搞清楚微珠上的spatial barcode序列，是通过用带红色或绿色荧光基团的杂交探针来搞清楚的。而且是通过多轮杂交。
每次杂交后，扫描芯片上每个微珠出发的光的颜色，看是发出红光还是绿光。
第一轮杂交，得到第一位的信息；第二轮杂交，得到第二位的信息，依次做下去，多轮杂交后，就可以把每个孔里微珠上的spatial barcode序列都搞清楚。
这样，微珠上的这段序列，就对应到芯片上的座标位置，
在高通量测序后，就可以把测序得到的reads数据还原到对应的空间位置上了。
这就是超高分辨率的空间转录组的工作原理
NO.5
总结
这篇文章为我们展示了通过：空间转录组、10x单细胞测序、原位测序三种方法的组合，加上对不同发育时期的心脏样本的分析，得到了一个完整的心脏发育时空图。
