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你不了解的单细胞拟时轨迹分析 | Dr.cell分享
发布日期：2019-10-18浏览：
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经常研究我们发育分化文章的小伙伴肯定知道这样一种分析方法——拟时序分析（pseudo-time）或者单细胞拟时轨迹（trajectory）分析，它指通过构建细胞间的变化轨迹来重塑细胞随着时间的变化过程。
基于此分析也开发了不少的软件与算法，比如经典的Monocle、SCUBA、STREAM、Wishbone等。Monocle从2014年nature biotechnology上被提出，到现在已经更新到Monocle3，是CNS主流期刊的常用软件，因此我们也使用monocle软件包中的DDRTree算法，步骤如下：
? 筛选细胞类（cluster）的所有差异表达基因；
? 降维并构建小生成树；
? 对单细胞进行在高维和低维空间搜索最优排序；
? 拟合最佳细胞发育或者分化拟时轨迹曲线。
然后我们就会看到一些极为漂亮的拟时轨迹图，下面我们一一来介绍：
（一）Fig. 1左图是不同cluster的细胞在轨迹曲线中的分布情况，这个图的起点或终点需要大家根据自己的研究背景来定义，比如cluster8的细胞可能是分化的起点，也可能是终点。因此首先需要搞清楚每个亚群的细胞类型（这个我们前面介绍过，详情查看→ 五、单细胞转录组测序分析核心知识点 ”），然后再去判断。当然也可以自行选择感兴趣的某一种或几种细胞来分析。
Figure 1
（二）Fig.1中间的图是不同state的细胞分布情况，Monocle将轨迹曲线分成不同的state，可以研究每个state细胞的基因表达。相应的，Fig2散点图是基因在每个state细胞的表达情况，这10个基因在state6中高表达，而state6的细胞属于cluster8这个亚群，那这些基因可能与这个亚群有某种关联。
Figure 2
（三）Fig.1右边的图是细胞拟时间值的分布情况，颜色越深表示拟时间值越大，可以找一下随拟时间值发生动态变化的基因，比如一直升高或一直降低，或者先升高在降低等。相对应的Fig3散点图是基因随拟时间值的动态表达情况。
Figure 3
（四）Fig4是基因随拟时间值的表达热图，表达趋势相似的基因会聚在一起，形成不同的cluster。从图中看到，分成了4个cluster，可以对每个cluster的基因集做功能或通路富集分析，从而帮助大家更好的了解细胞分化的过程。
Figure 4
（五）Fig5也是基因随拟时间值的表达热图，但不太一样的是这个图是不同分支的基因热图，如右图所示。细胞可能会分化成不同的类型，所以会有很多分支，那我们可以研究下不同分支之间的差异基因，而这些基因可能就是决定细胞分化命运的关键。
Figure 5
拟时轨迹分析主要用于细胞发育分化的研究，若再细分一下，可分为胚胎发育、各组织细胞的发育过程、细胞重编程、疾病的发展进程、癌细胞的分化、肢体再生的研究等。 大家如果之前没有接触过，可能对以上的结果图感到难以理解，别担心，Dr. cell会结合具体文献案例给大家逐一介绍，这么多方向总有一款适合你。我们今天的主题是细胞重编程。
细胞重编程
细胞重编程指在特定的条件下，分化细胞被逆转并恢复到全能性状态，形成胚胎干细胞系，或进一步发育成新个体的过程。介导重编程的方法主要有4种：体细胞核移植、细胞融合、特定因子转导及体外培养筛选。下面通过一篇文献来了解一下吧。
01 研究目的
化学重编程可以帮助研究者探索体细胞在变成多能性细胞过程中的分子动态变化，尽管之前有研究报道过该过程的中间XEN-like状态，但对于细胞获得多能性的分子研究及完整的多能性分子网络构建仍旧是不足的。
02 主要结果
通过化学诱导使小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）发生重编程，取12个时间点的细胞（36199cells，图1A）进行10X单细胞转录组测序，t-SNE分析共得到6个cluster：MEFs, reprogrammed cells in stage I, XEN-like cells, further reprogrammed cells in stage II and III, CiPSCs, Ci2C-like cells（图1B）。
?图1 化学重编程细胞的聚类分析
为了重现重编程轨迹，对所有细胞进行拟时轨迹分析（Monocle2），结果显示在分支前(pre-branch)，MEFs会转化成XEN-like（Extraembryonic endoderm -like）细胞，这也证实了作者之前的发现（CiPSCs是由XEN-like细胞形成）。在XEN-like细胞形成后，会立刻分成两支。其中一个分支（successful branch）的末端细胞表达多能性基因，和ESCs 表达谱高度相似，代表成功重编程的CiPSCs；而另一分支（failed branch ）的末端细胞表达XEN基因，表示重编程失败的细胞（图2）。
图2 重编程细胞拟时轨迹分析
为了研究整个重编程过程基因动态表达的情况，对1518个差异基因进行聚类分析，分成5个类别。接着对successful branch进行分析，Cluster I中的基因（成纤维细胞基因）随着重编程逐渐下调，主要参与生物过程的调节，如collagen fibril organization。 cluster II 和 III 中的基因（XEN基因和2C 基因）先瞬时上调后来又下调，表示两个短暂的过程。cluster IV 中的基因（早期的多能性基因）上调，直到后期也一直保持高表达水平。cluster V 中的基因（晚期的多能性基因）在重编程后期被激活，主要参与“stem cell population maintenance”（图3）。
图3 化学重编程过程中基因的动态变化
将两个分支的细胞分别又分成earlier stage (class A) 和 later stage(class B)，与Failed branch细胞相比，在successful branch class A 中上调表达的基因主要参与"positive regulation of cell proliferation"，"negative regulation of differentiation"和"stem cell maintenance"，包括几乎所有的2C基因和一些早期多能性基因。下调基因主要是一些中内胚层发育的调节子，比如XEN基因。在successful branch class B细胞中，XEN基因被进一步沉默，晚期多能性基因被激活（图4）。
图4 化学重编程过程中差异基因热图及散点图
基于1518个差异基因构建基因互作网络，主要分为3个子网络，从时间进程上分别为XEN subnetwork（主要是2C基因），intermediate subnetwork（包括2C基因和早期多能性基因），pluripotency subnetwork（主要是早期多能性基因）。intermediate subnetwork作为桥梁，连接其他两个子网络（图5H）。另外，intermediate subnetwork中的基因表达模式与别人报道的早期胚胎发育（从2C到囊胚期）过程的表达模式相似，说明这些基因在细胞重编程中起关键作用（图5J）。
图5 化学重编程过程中差异基因互作网络
最后作者还针对intermediate subnetwork中的基因做了敲降及过表达实验，验证这些基因对重编程的影响。通过刺激某些基因的表达，可以提高细胞重编程效率。
一句话总结：对所有时间点的细胞进行拟时轨迹分析来重现细胞重编程的过程，然后比较不同分支细胞的基因表达差异以及同一分支细胞中基因的动态变化，找到影响重编程进程的关键因子。
参考文献：
Zhao T, Fu Y, Zhu J, et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Dynamic Early Embryonic-like Programs during Chemical Reprogramming. Cell Stem Cell. 2018 Jul 5;23(1):31-45.e7. doi: 10.1016/j.stem.2018.05.025.
