Engage to Life Energy
10x单细胞新世界——大规模单细胞拷贝数分析
发布日期：2019-09-20浏览：
次
过去进行基因组测序使用的测序材料，大部分都是数百万甚至更多细胞的混合DNA样本。这种方法能够得到全基因组序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性被忽视。
单细胞测序——一种能在单个细胞水平上对基因组进行测序的技术能够解决上述难题。
其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA扩增建库，进而通过高通量测序来揭示细胞群体差异和细胞进化关系。
目前主要有2种策略来实现单细胞测序：
一、使用流式细胞术或激光捕获显微切割等技术。
将单个细胞分离出来，使用全基因组扩增技术，如DOP-PCR、MDA、MALBAC等，独立构建测序文库，最终进行测序[1]。这种策略随待测单细胞个数的增长，测序成本几乎呈线性升高。因此，为了满足现阶段的研究需求，下面第二种策略随之产生。
二、基于标签（barcode）的单细胞识别。
方法是给每个细胞加上标签序列，那么携带相同barcode的序列便视为来自同一个细胞。这样，通过一次建库，即得到数百上千个单细胞的信息。10x单细胞CNV便是基于这个策略实现单细胞分辨率的拷贝数分析。
目前，dafabet手机黄金版已全面开展10x Genomics单细胞CNV测序，助你在单细胞层面研究拷贝数变异，揭示基因组异质性和细胞的克隆进化模式，确定发病机制和疾病进展。
话不多说，让我们先一起探索吧！
1 它是如何形成大规模单细胞体系的？（实验流程和常规10x 3’ scRNA略有不同哦）
2 为什么要用这个技术，有何优势？
3 该如何送样？
4 10x单细胞CNV能得到怎样的结果？
图1 10x单细胞CNV解决方案（仪器、试剂盒和可视化软件）
它是如何形成大规模单细胞体系的？
10x 单细胞CNV利用双十字微流控系统分离单细胞，通过Gel Beads上的barcode标记DNA。
每个gel bead有很多寡聚核苷酸链：
22 bp的Illumina Read 1(R1) sequence
16 bp 10x Barcode
两步捕获
第一步，使用微流体芯片捕获单个细胞，形成cell beads。随后保持凝胶珠整体结构的前提下，裂解其中的细胞，去除所有核蛋白质以及RNA等，仅保留基因组DNA。
第二步，将cell beads与Gel Beads通过微流控技术形成标记的单细胞组分（GEM），每个cell bead与一个gel bead包裹在一起。
然后，Gel Bead破裂，释放寡聚核苷酸链，每个gel bead有特有的10x barcode序列，10x barcode连接到扩增的DNA片段上，来自一个细胞的DNA连接相同的10x barcode。
最后，油滴破裂，加测序接头，完成建库，进行上机测序，文库如下：
建议测序数据量：750,000 read pairs/cell (1.5M total reads/cell)
测序模式：2×150
这个技术有什么优势？
1. 通量高，可以同时检测成千个细胞
2. 可准确检出单细胞CNV事件，分辨率达2 Mb
3. 可检测细胞簇中低至100 Kb的CNV事件
4. 样本可以是细胞系、原代细胞、新鲜和冻存组织
5. 亚克隆检测灵敏度高，可检测低频亚克隆
要如何送样？
细胞类型：单细胞悬液、组织样本、细胞核
样本类型：新鲜、冻存组织
细胞大小：直径 < 30 um
细胞活性：>80%
细胞数或细胞核数：>30000 浓度：700-1200个/ul
细胞总得率：15%，基于细胞总得率和目的细胞数，确定上样细胞数
注：更多特殊样本或个性化的要求可联系dafabet黄金手机版当地销售，与实验室商定后进行。
10x单细胞CNV能得到怎样的结果？
1. 每个细胞的CNV热图
注：横坐标表示染色体编号，一行代表一个细胞的拷贝数，白色表示拷贝数为2，红色表示扩增，蓝色表示缺失。
2. 肿瘤异质性，区分癌和癌旁细胞
2053个单细胞CNV分析：可区分癌和癌旁细胞，可鉴定肿瘤组织的异质性。
3. 研究癌组织空间异质性和亚型丰度检测
将一块乳腺癌组织横切为两部分（S1/S2）。随后，对两块组织分别进行了以单细胞 CNV 为基础的细胞分型。结果显示，两个组织中的细胞分型差异显著，表示即便是来源于同一个肿瘤组织，不同细胞依然存在着空间上的分型。每部分组织可以分析出各亚型比例。
4、确定细胞周期
左图是基于scDNA确定细胞周期，右图是与流式分选的结果进行比较。
5、与10x单细胞转录组结合分析
通过联合分析可以确定样本中细胞间潜在的基因组改变、亚克隆细胞多样性和转录组特征。如下图，b和c分别表示scDNA和scRNA基于CNV推断出的4个克隆亚型，d图表示scRNA发现的每个CNV谱在scDNA数据中都有一个等效的CNV谱，并且具有相同百分比的细胞。e图表示2个克隆亚型（绿色和紫色）之间的拷贝数差异，并展示了有克隆特异性差异CNVs的癌症基因，灰色条带是只能用scDNA检测出的CNV。
参考文献：
1. C. Gawad, W. Koh, S.R. Quake, Single-cell genome sequencing: current state of the science, Nature Reviews Genetics 17(3) (2016) 175.
2. Andor N et al.Joint single cell DNA-Seq and RNA-Seq of gastric cancer reveals subclonal signatures of genomic instability and gene expression. Biorxiv. 2018 Oct 17.doi: 10.1101/445932.
2. Andor N et al.Joint single cell DNA-Seq and RNA-Seq of gastric cancer reveals subclonal signatures of genomic instability and gene expression. Biorxiv. 2018 Oct 17.doi: 10.1101/445932.过去进行基因组测序使用的测序材料，大部分都是数百万甚至更多细胞的混合DNA样本。这种方法能够得到全基因组序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性被忽视。
单细胞测序——一种能在单个细胞水平上对基因组进行测序的技术能够解决上述难题。
其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA扩增建库，进而通过高通量测序来揭示细胞群体差异和细胞进化关系。
目前主要有2种策略来实现单细胞测序：
一、使用流式细胞术或激光捕获显微切割等技术。
将单个细胞分离出来，使用全基因组扩增技术，如DOP-PCR、MDA、MALBAC等，独立构建测序文库，##终进行测序[1]。这种策略随待测单细胞个数的增长，测序成本几乎呈线性升高。因此，为了满足现阶段的研究需求，下面第二种策略随之产生。
二、基于标签（barcode）的单细胞识别。
方法是给每个细胞加上##的标签序列，那么携带相同barcode的序列便视为来自同一个细胞。这样，通过一次建库，即得到数百上千个单细胞的信息。10x单细胞CNV便是基于这个策略实现单细胞分辨率的拷贝数分析。
目前，dafabet手机黄金版已全面开展10x Genomics单细胞CNV测序，助你在单细胞层面研究拷贝数变异，揭示基因组异质性和细胞的克隆进化模式，确定发病机制和疾病进展。
话不多说，让我们先一起探索吧！
1 它是如何形成大规模单细胞体系的？（实验流程和常规10x 3’ scRNA略有不同哦）
2 为什么要用这个技术，有何优势？
3 该如何送样？
4 10x单细胞CNV能得到怎样的结果？
图1 10x单细胞CNV解决方案（仪器、试剂盒和可视化软件）
它是如何形成大规模单细胞体系的？
10x 单细胞CNV利用双十字微流控系统分离单细胞，通过Gel Beads上的barcode标记DNA。
每个gel bead有很多寡聚核苷酸链：
22 bp的Illumina Read 1(R1) sequence
16 bp 10x Barcode
两步捕获
##步，使用微流体芯片捕获单个细胞，形成cell beads。随后保持凝胶珠整体结构的前提下，裂解其中的细胞，去除所有核蛋白质以及RNA等，仅保留基因组DNA。
第二步，将cell beads与Gel Beads通过微流控技术形成标记的单细胞组分（GEM），每个cell bead与一个gel bead包裹在一起。
然后，Gel Bead破裂，释放寡聚核苷酸链，每个gel bead有特有的10x barcode序列，10x barcode连接到扩增的DNA片段上，来自一个细胞的DNA连接相同的10x barcode。
##后，油滴破裂，加测序接头，完成建库，进行上机测序，文库如下：
建议测序数据量：750,000 read pairs/cell (1.5M total reads/cell)
测序模式：2×150
这个技术有什么优势？
1. 通量高，可以同时检测成千个细胞
2. 可准确检出单细胞CNV事件，分辨率达2 Mb
3. 可检测细胞簇中低至100 Kb的CNV事件
4. 样本可以是细胞系、原代细胞、新鲜和冻存组织
5. 亚克隆检测灵敏度高，可检测低频亚克隆
要如何送样？
细胞类型：单细胞悬液、组织样本、细胞核
样本类型：新鲜、冻存组织
细胞大小：直径 < 30 um
细胞活性：>80%
细胞数或细胞核数：>30000 浓度：700-1200个/ul
细胞总得率：15%，基于细胞总得率和目的细胞数，确定上样细胞数
注：更多特殊样本或个性化的要求可联系dafabet黄金手机版当地销售，与实验室商定后进行。
10x单细胞CNV能得到怎样的结果？
1. 每个细胞的CNV热图
注：横坐标表示染色体编号，一行代表一个细胞的拷贝数，白色表示拷贝数为2，红色表示扩增，蓝色表示缺失。
2. 肿瘤异质性，区分癌和癌旁细胞
2053个单细胞CNV分析：可区分癌和癌旁细胞，可鉴定肿瘤组织的异质性。
3. 研究癌组织空间异质性和亚型丰度检测
将一块乳腺癌组织横切为两部分（S1/S2）。随后，对两块组织分别进行了以单细胞 CNV 为基础的细胞分型。结果显示，两个组织中的细胞分型差异显著，表示即便是来源于同一个肿瘤组织，不同细胞依然存在着空间上的分型。每部分组织可以分析出各亚型比例。
4、确定细胞周期
左图是基于scDNA确定细胞周期，右图是与流式分选的结果进行比较。
5、与10x单细胞转录组结合分析
通过联合分析可以确定样本中细胞间潜在的基因组改变、亚克隆细胞多样性和转录组特征。如下图，b和c分别表示scDNA和scRNA基于CNV推断出的4个克隆亚型，d图表示scRNA发现的每个CNV谱在scDNA数据中都有一个等效的CNV谱，并且具有相同百分比的细胞。e图表示2个克隆亚型（绿色和紫色）之间的拷贝数差异，并展示了有克隆特异性差异CNVs的癌症基因，灰色条带是只能用scDNA检测出的CNV。
参考文献：
1. C. Gawad, W. Koh, S.R. Quake, Single-cell genome sequencing: current state of the science, Nature Reviews Genetics 17(3) (2016) 175.
2. Andor N et al.Joint single cell DNA-Seq and RNA-Seq of gastric cancer reveals subclonal signatures of genomic instability and gene expression. Biorxiv. 2018 Oct 17.doi: 10.1101/445932.
