自从1993年在线虫中发现了第一个miRNAlin-4，过去的20年里miRNA的研究一直非常火热，从单一的研究到与其他组学结合，套路一直未变，胞浆miRNA可降解靶基因或抑制其翻译。随着研究的增多，miRNA抑制机制的研究似乎已到了瓶颈期，名气也被新发现的lncRNA，circRNA比了下去。但是“柳暗花明又一村”，去年2月份复旦大学于文强课题组发表在RNA Biology上的一篇miRNA激活机制的文章，揭示了核内miRNA可通过结合增强子，改变增强子的染色质状态，从而激活基因的转录表达[1]。今年的3月份诺贝尔奖得主Phillip Sharp在Cell上发表的文章，研究结果进一步印证了miRNA激活理论[2]。也就是说miRNA具有双重功能，当位于胞浆时可抑制基因表达；当位于细胞核内可激活基因的转录。今天就先解读一下于教授的这篇文章，希望能为大家提供新的miRNA研究思路~
摘要
miRNA是一种小非编码RNA分子，对基因的表达有负调控作用。最新研究显示miRNA除了位于胞浆，还存在于细胞核内，然而核内miRNA的作用机制目前还不了解。通过筛选miRNA数据库，作者找到许多作为增强子调节器的miRNA，其中的一些可激活基因表达。以miR-24-1 为例，可以与增强子结合激活基因转录，但是当这个增强子序列被TALEN删除后激活作用会终止。而且作者发现miR-24-1可激活增强子RNA（eRNA）的表达，改变组蛋白修饰，提高p300 及RNA Pol II 在增强子区域的富集。
研究思路
>miRNA筛选
从miRBase库中筛选位于增强子区域的人类miRNA，而且该区域要有H3K27ac富集。
>miRNA定位
FISH对挑选的miRNA进行定位，倾向于位于核内。
>miRNA过表达/敲低
通过miRNA敲低/过表达检测邻近基因（400bk以内）的表达水平，发现miRNA过表达时会提高邻近基因的表达，反之会降低邻近基因的表达。
>增强子区域的完整度影响miRNA行使功能
利用TALE技术删除增强子序列，验证邻近基因表达水平，发现当增强子不完整时,miRNA无法激活基因转录。
>增强子区域染色质状态的改变
将miRNA过表达后会招募RNA Pol II，P300/CBP, AGO2, 使组蛋白修饰H3K27ac水平增加，H3K4me1水平降低，导致染色质状态发生改变，促进基因转录。
>miRNA可以结合和激活靶标增强子
miRanda预测显示活性增强子区域有miRNA的靶结合位点，miRNA结合并激活靶标增强子，从而促进邻近基因转录。
研究结果
1. 从miRBase库中筛选位于增强子区域的人类miRNA
作者在7种不同的组织细胞中，对1 594条miRNA前体进行了分析，发现有300多条miRNA前体在基因组中的位置与增强子的组蛋白修饰标志H3K27ac富集区域高度重叠(Fig. 1A ）。以GM12878细胞系为例，发现H3K4me1, p300/CBP, DNase-I-hypersensitive sites 富集区域与miRNA位置也重叠，与H3K27ac模式相似(Fig. 1B）。以上证据表明miRNA与增强子有关。另外，作者还发现位于H3K27ac富集区域的miRNA倾向于存在细胞核内，核内miRNA与邻近基因的表达呈正相关(Fig. 1B ）。
Figure 1 | Classification and characterization of enhancer-associated miRNAs.
2.增强子区域的miRNA具有转录激活功能
作者推测在增强子区域的miRNA与在启动子区的miRNA功能类似，可调节邻近基因的表达。为了验证该假设，作者选择miR-26a-1，其400kb以内的基因包括ITGA9, CTDSPL, VILL，PLCD1 。将miR-26a-1过表达后，ITGA9和VILL表达量明显增加, 为了进一步证明，又将miR-339过表达，发现邻近的基因GPER表达量增加了4倍(Fig. 2A）。
接着又对miR-3179，miR-3180进行分析，两个分子均位于NOMO 和PKD1P1的间区，但H3K27ac富集水平显著不同(Fig. 2B）。首先，萤光素酶报告实验显示含有miR-3179的DNA片段具有增强子活性，而含有miR-3180的不具有增强子活性，显示H3K27ac富集是潜在增强子的可靠标记。将miR-3179转染到细胞系，发现邻近基因ABCC6（3倍）、PKD1P1（5倍）显著上调。而转染miR-3180后邻近基因没有变化(Fig. 2B），显示miRNA的激活功能与增强子活性及组蛋白修饰水平有关。
为了进一步研究miRNA功能，作者选择miR-24-1（chromosome 9），miR-24-2（chromosome 19），二者成熟序列完全相同，但前体来自于不同的染色体，邻近基因不同，结果显示miR-24-1，miR-24-2都可以激活它们的邻近基因。另外，Northern blotting显示，当pre-miR-24过表达后，成熟体miR-24同时存在于细胞质与细胞核内，说明pre-miRNA的转染不仅增加胞浆内的miRNA表达，还能增加核内miRNA表达。继续以miR-24-1 为对象进行研究，检测邻近基因FBP1，FANCC的蛋白水平，结果显示增加(Fig. 2C)。同时，胞浆内的miR-24-1靶基因下调，显示miRNA在胞浆内正常发挥抑制作用。
前面都是将miRNA前体转染到细胞系中，为了证明miRNA成熟体的作用，将miR-24 mimics，miR-3179 mimics分别转染到细胞，发现可以提高邻近基因的表达水平（Fig. 2D）。又做了miR-24的敲低实验，qPCR显示邻近基因表达明显下调（Fig. 2E）。
Figure 2 | Enhancer associated miRNA mediates transcriptional gene activation.
3.miR-24-1促进基因转录需要依赖完整的增强子
在miR-24-1种子区域进行删除或突变处理，发现miRNA诱导的转录激活作用终止(Fig. 3A,B)。利用TALE技术删除miR-24-1所在的增强子区域(Fig. 3C )，增强子区域被破坏，miRNA表达明显下降。在TALEN删除的细胞中，即使在miR-24-1过表达的条件下，miR-24-1邻近基因也不能被激活(Fig. 3D,E)，然而miR-24-2的邻近基因表达水平上调。以上结果表明miRNA对邻近基因的转录激活需要依赖完整的增强子。
Figure 3 | miRNA mediated transcriptional gene activation requires the intact miRNA and its targeted enhancer.
4.miR-24-1需要通过提高内源miRNA表达及增强子染色质状态的改变来行使功能
通过染色实验发现miR-24-1 确实可以进入核内。为了确定内源miRNA是否参与miRNA的功能，将miR-24-1 mimics转染后发现miR-24-1 前体水平显著增加，说明在有活性的增强子区域，外源miRNA能够增加内源miR-24 的表达(Fig.4A）。先前报道称AGO2在核内也存在并发挥作用，作者将AGO2敲低，miR-24-1 邻近基因表达水平显著下调，说明AGO2 可能对于miR-24的活性有影响（Figure 4B）。另外也有报道增强子活化与RNA聚合酶II有关，本文结果显示当miR-24-1过表达后，RNAPII，AGO2 ，p300/CBP 在miR-24-1增强子区域富集，而且将miR-24-1, miR-26a-1, miR-339, miR-3179分别转染到细胞后，活性增强子产生的eRNA含量增加(Fig. 4D）。同时，活性增强子标记H3K27ac增加，抑制标记降低，NOMe-Seq 结果显示在miR-24-1增强子区域和FBP1启动子区的蛋白位置发生明显改变(Fig. 4E）。以上结果表明miR-24-1过表达后会导致内源miR-24表达量增加，增强子的染色质状态发生改变，参与基因的激活。
Figure 4 | Epigenetic events involved in miRNAs’ transcriptional activation.
5.miR-24-1通过结合和激活靶标增强子促进大量基因的转录
基因芯片数据显示miR-24-1过表达可以上调一些基因的表达，也可以下调另一些基因的表达(Fig. 5A)。miRanda分析显示下调的基因3’UTR与miR-24-1有更多的潜在结合位点，表明miRNA通常在细胞质内行使功能。作者通过ChIP-seq分析显示，miR-24-1过表达的细胞内，活性增强子标记H3K27ac显著富集在3282个增强子区域，并且在这些区域找到了与miR-24-3p种子序列相似的motif，重要的是3282个增强子中有60.42% 的区域被miRanda预测为miR-24-1的靶位点(Fig. 5B)。另外，上调的基因倾向于位于活性增强子两侧(Fig. 5C)，比如在miR-24-1过表达的细胞中，miR-24-1的靶向增强子上H3K27ac, H3K4me1，Pol Ⅱ显著富集，H3K9me3 富集减少(Fig. 5D)，从而促使KDM6B基因上调。另外还发现miR-24-1也能激活远端基因-DUSP16，ENO3的转录。为了进一步证明增强子完整度的重要性，利用TALEN删除miR-24-1的靶向增强子序列，导致邻近基因KDM6B, LSMD1,CYB5D1上调终止，即使miR-24-1过表达也于事无补。
Figure 5 | miRNAs may activate genome-wide gene transcription.
总结：从本文来看，miRNA核内激活机制的基本思路是核内miRNA可与增强子结合，招募RNA Pol II，P300/CBP, AGO2到增强子区域, 使组蛋白修饰H3K27ac水平增加，H3K4me1水平降低，导致染色质状态发生改变，增强子活化，从而促进miRNA邻近基因转录。
参考文献：
[1] Min Xiao, Jin Li, Wei Li, Yu Wang, Feizhen Wu, Yanping Xi, Lan Zhang, Chao Ding, Huaibing Luo, Yan Li, Lina Peng, Liping Zhao, Shaoliang Peng, Yao Xiao, Shihua Dong, Jie Cao & Wenqiang Yu (2016): MicroRNAs Activate Gene Transcription Epigenetically as an Enhancer Trigger, RNA Biology, DOI: 10.1080/15476286.2015.1112487
[2] Hiroshi I. Suzuki, Richard A. Young,Phillip A. Sharp.(2017):Super-Enhancer-Mediated RNA Processing Revealed by Integrative MicroRNA Network Analysis, Cell 168, 1000–1014.
