导读：文章于2017年10月25日发表在《science》上，研究结合单核转录组测序及荧光标记技术对成体神经元发生的动态过程进行研究。
单细胞测序为细胞分型及细胞状态的研究提供了丰富的信息，但却难以捕获稀有的，诸如成体神经元发生的动态过程，这是由于难以从成体中分离获得稀有神经元，并且神经元发生过程的每个阶段的标记也都十分有限。
本研究发明了一种Div-seq技术，可以利用5-乙炔-2-脱氧尿嘧啶(EDU)作为细胞增殖的动态标记与将单核转录组测序相结合，追踪分化的细胞。单核细胞测序及Div-seq可以在成体海马中实现高灵敏辨别细胞类型并追踪新生神经元转录的动态变化。此外，研究还利用Div-seq阐明了成体脊髓中的稀有新生神经元构成模式。单核转录组测序及Div-seq技术开启了高保真研究不同来源复杂组织的新通路。
材料与方法：
1. 构建质粒及病毒(AAV1/2)，以收集目标神经元。
2. 定向进行鼠脑的AAV1/2注射标记。进行免疫组化及尼氏染色。
3. 单核转录组测序：对鼠脑的海马区进行解剖分选，取DG、CA1、CA2、CA3区域的细胞进行验证。此外，通过密度梯度离心法富集细胞核，通过流式细胞仪分选用于研究的标记细胞核，进行单核转录组测序。
4. 此外，还进行了组织转录组测序，荧光原位杂交实验，用于验证等。
主要结果：
1. 单核转录组测序进行成体鼠脑的细胞分型：传统单细胞测序是通过咦酶消化的方法从组织中分离获得单细胞进行转录组测序，本文用到的方法是通过密度梯度离心法获得神经元的细胞核，经过流式分选之后对单细胞核进行转录组测序（Fig. 1A）；在对1188个细胞核进行单核测序之后通过tSNE分析获得成体鼠海马部分的细胞分型，可以明确将海马细胞亚型分开（Fig.1B）。不同亚型的细胞具有亚型特异的基因表达（Fig.1C），这一点在原位杂交试验中得到验证，并且可以得到不同细胞类群的marker gene（Fig.1D）。
2. 单核转录组测序及biSNE分析划分细胞亚型及特异性表达模式：基于单核转录组测序进行细胞分型的结果，采用biSNE分析，可以进一步细化不同细胞类群的亚群分型（Fig.2A），对CA1细胞群及CA3细胞群进行亚群的划分，可以与它们的解剖学位置相互对应（Fig.2B）并利用Allen的原位杂交数据，验证了不同细胞亚群的表达模式（Fig.2C）；此外，研究还挖掘出了特定细胞类型或细胞位置的代表性基因（Fig.2D），并通过FISH和Allen ISH进行了验证（Fig.2E）。
3. Div-seq监测成体神经元发生的转录动态过程：采用EDU标记结合sNuc-seq的方法（Div-seq）,对小鼠神经元进行标记及单核转录组测序（Fig.3A），取EDU标记1-28天样本进行神经干细胞分化过程跟踪（Fig.3B）；基于biSNE分析结果显示，不同时间节点的细胞呈现时间顺序性变化过程，且各个时间节点的代表性基因的表达也呈现与之对应的表达特点（Fig.3C）。遵循神经干细胞分化过程的事件顺序性，对细胞的基因簇表达模式进行分析，也获得了神经元从神经祖细胞到分化成熟的全过程中，细胞的代表性基因簇及其表达模式的变化特征（Fig.3D）.
4. 脊髓中成体新生GABAergic神经元的动态发育过程的研究：研究对脊髓中的细胞类群及新生神经元发育过程进行了DIV-seq研究，通过EDU标记培养，比较标记前及标记一周后脊髓的细胞类群变化情况（Fig.4A）;并重点关注GABAergic神经元与非成熟神经元的marker gene 在不同细胞类群中的表达情况（Fig.4B），证实GABAergic神经元正处在分化过程中。根据标记后时间顺序性的追踪，发现脊髓中新生神经元的发生也遵循顺序性过程（Fig.4C）。比较脊髓与背根神经元的发生轨迹，研究者找到了347个共有基因，并对基因的表达模式进行了分析（Fig.4D），发现脊髓与背根神经元的发生及表达动态过程和分支也是有着显著性的差异的（Fig.4D&4E），这可能与二者在时间尺度，细胞类型及胶质细胞及神经元发生过程上的差异相关。此外，研究者还发现,在不同的解剖位置上的非成熟细胞，也存在表达模式的组织特异性差异（Fig.4F）。
参考文献：Div-seq: Single-nucleus RNA-seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science,2017.
导读：
文章于2017年10月25日发表在《science》上，研究结合单核转录组测序及荧光标记技术对成体神经元发生的动态过程进行研究。
单细胞测序为细胞分型及细胞状态的研究提供了丰富的信息，但却难以捕获稀有的，诸如成体神经元发生的动态过程，这是由于难以从成体中分离获得稀有神经元，并且神经元发生过程的每个阶段的标记也都十分有限。
本研究发明了一种Div-seq技术，可以利用5-乙炔-2-脱氧尿嘧啶(EDU)作为细胞增殖的动态标记与将单核转录组测序相结合，追踪分化的细胞。单核细胞测序及Div-seq可以在成体海马中实现高灵敏辨别细胞类型并追踪新生神经元转录的动态变化。此外，研究还利用Div-seq阐明了成体脊髓中的稀有新生神经元构成模式。单核转录组测序及Div-seq技术开启了高保真研究不同来源复杂组织的新通路。
材料与方法：
1. 构建质粒及病毒(AAV1/2)，以收集目标神经元。
2. 定向进行鼠脑的AAV1/2注射标记。进行免疫组化及尼氏染色。
3. 单核转录组测序：对鼠脑的海马区进行解剖分选，取DG、CA1、CA2、CA3区域的细胞进行验证。此外，通过密度梯度离心法富集细胞核，通过流式细胞仪分选用于研究的标记细胞核，进行单核转录组测序。
4. 此外，还进行了组织转录组测序，荧光原位杂交实验，用于验证等。
主要结果：
1. 单核转录组测序进行成体鼠脑的细胞分型：传统单细胞测序是通过咦酶消化的方法从组织中分离获得单细胞进行转录组测序，本文用到的方法是通过密度梯度离心法获得神经元的细胞核，经过流式分选之后对单细胞核进行转录组测序（Fig. 1A）；在对1188个细胞核进行单核测序之后通过tSNE分析获得成体鼠海马部分的细胞分型，可以明确将海马细胞亚型分开（Fig.1B）。不同亚型的细胞具有亚型特异的基因表达（Fig.1C），这一点在原位杂交试验中得到验证，并且可以得到不同细胞类群的marker gene（Fig.1D）。
2. 单核转录组测序及biSNE分析划分细胞亚型及特异性表达模式：基于单核转录组测序进行细胞分型的结果，采用biSNE分析，可以进一步细化不同细胞类群的亚群分型（Fig.2A），对CA1细胞群及CA3细胞群进行亚群的划分，可以与它们的解剖学位置相互对应（Fig.2B）并利用Allen的原位杂交数据，验证了不同细胞亚群的表达模式（Fig.2C）；此外，研究还挖掘出了特定细胞类型或细胞位置的代表性基因（Fig.2D），并通过FISH和Allen ISH进行了验证（Fig.2E）。
3. Div-seq监测成体神经元发生的转录动态过程：采用EDU标记结合sNuc-seq的方法（Div-seq）,对小鼠神经元进行标记及单核转录组测序（Fig.3A），取EDU标记1-28天样本进行神经干细胞分化过程跟踪（Fig.3B）；基于biSNE分析结果显示，不同时间节点的细胞呈现时间顺序性变化过程，且各个时间节点的代表性基因的表达也呈现与之对应的表达特点（Fig.3C）。遵循神经干细胞分化过程的事件顺序性，对细胞的基因簇表达模式进行分析，也获得了神经元从神经祖细胞到分化成熟的全过程中，细胞的代表性基因簇及其表达模式的变化特征（Fig.3D）.
4. 脊髓中成体新生GABAergic神经元的动态发育过程的研究：研究对脊髓中的细胞类群及新生神经元发育过程进行了DIV-seq研究，通过EDU标记培养，比较标记前及标记一周后脊髓的细胞类群变化情况（Fig.4A）;并重点关注GABAergic神经元与非成熟神经元的marker gene 在不同细胞类群中的表达情况（Fig.4B），证实GABAergic神经元正处在分化过程中。根据标记后时间顺序性的追踪，发现脊髓中新生神经元的发生也遵循顺序性过程（Fig.4C）。比较脊髓与背根神经元的发生轨迹，研究者找到了347个共有基因，并对基因的表达模式进行了分析（Fig.4D），发现脊髓与背根神经元的发生及表达动态过程和分支也是有着显著性的差异的（Fig.4D&4E），这可能与二者在时间尺度，细胞类型及胶质细胞及神经元发生过程上的差异相关。此外，研究者还发现,在不同的解剖位置上的非成熟细胞，也存在表达模式的组织特异性差异（Fig.4F）。
参考文献：Div-seq: Single-nucleus RNA-seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science,2017.
