Hello, everyone, this is Dr. cell.
又到了两周一度的专栏时间。还记得之前讲了什么吗？内容很多，消化的怎么样？
☞ 深入浅出解读单细胞转录组测序技术路线
☞ 细数大规模单细胞转录组测序平台
☞ 如何选择跟你最搭的10x单细胞转录组测序应用？
简单回顾下上期~
10x Genomics单细胞测序应用场景
上期基于已发表的300多篇10X单细胞转录组文章(文献集合在这里：https://www.10xgenomics.com/resources/publications ），我们总结出细胞异质性研究、免疫反应、定点编辑基因的细胞水平研究发育及分化新型细胞发现、构建细胞图谱以及肿瘤（微环境/耐药/免疫等）等常见研究思路，教大家如何将单细胞测序与自身课题有效结合（适合自己的，才是最好的！）
单细胞转录组测序文章发的很多，涉及的细胞类型也多种多样，如肠、肺、PBMC、胚胎、神经、乳腺、干细胞等，而这里样本的处理消化亦是重中之重，样本前处理与后续的分析结果有着莫大的关联。如何得到最优质的悬液上机呢？待我娓娓道来~
这些组织样本或全血样本的单细胞悬液制备，我们都能处理哟，是不是很给力！详情咨询我们当地小伙伴！。
接下来，先一个小问题考考大家，10X单细胞测序的完整步骤知道吗？
1. 单细胞悬液制备→对于动物样本的需要处理成单细胞悬液，对于植物细胞来说需要利用果胶酶和纤维素酶去除细胞，将原生质体提供给我们；
2. 样本准备好之后，我们资深的实验人员携带10X迷你很cute的仪器上门进行油包水的制备等，
3. 后续对接illumina Novaseq 6000测序仪；
4. 数据下机之后，生物信息分析部门会进行分析，最后结果以图表、网页版等形式打包给老师。
重中之重的“单细胞悬液制备”来啦~
样本前期单细胞悬液制备这部分，有的老师可能会因没有相应的实验经验等忧虑，但我们现在可以提供为老师制备单细胞悬液的服务了，我们有美天旎公司细胞消化仪器，也有消化细胞方面经验资深的实验人员。
对于自己消化细胞的老师来说，在样本处理这部分，我们需要注意哪些呢？以下结合资深技术员的经验以及文献资料做的小小总结，助你一臂之力！
1. 血样样本，其细胞类型非常丰富，处理方式相对于组织来说比较简单。常用传统密度梯度离心的方法分离出淋巴细胞、单核细胞，目前大部分的研究选择Sigma的 Ficoll-Paque 或 Histopaque-1077 密度梯度法；另外，美天旎公司提供一项分离血液中特定的免疫细胞技术-MACS MicroBead 技术，不需要实施额外的梯度离心[1-2]。
2. 常见的组织类型：肝脏[3]、心脏[4]、肺脏[5]、神经系统[6-7]、脂肪组织[8-10]、血管[11-12]、肿瘤组织[13-14]......
传统组织处理方法有机械法，包括网搓法、研磨法，一般适用样本类型为脾脏、淋巴结、胸腺；另外，较温和的酶解法：胰蛋白酶类、胶原酶、溶菌酶、弹性蛋白酶以及一些商业化包装的组合酶，适用样本类型有肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脊髓、脑、肠道、皮肤、肿瘤等。关于组织样本的消化处理方法，题为《Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies》的综述结合大量文献进行一系列的总结，爱学习的同学可以仔细阅读[15]。
表 通过组织特异性酶处理来制备单细胞悬液（人和小鼠样品）
细胞在处理过程受到外界环境影响，其基因表达谱可能会出现一些变化；有些细胞对环境极为敏感，可能会死亡裂解，造成RNA降解从而造成检测中的背景细胞升高，进而影响所获得的数据质量。因此实验过程中需要尽量避免细胞死亡，不断优化细胞处理条件，加快实验流程的进度，减小对细胞的影响。
关于细胞处理，10x Genomics 公司为大家提供了一些帮助（网址：https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep）。
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如果已经处于悬浮状态的细胞或磁珠富集的细胞以及一些流式分选下来的细胞只需要进行清洗、细胞计数等，后续利用10X仪器、illumina测序平台研究单细胞转录组或免疫表达谱等。
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在处理组织类样本时，必须首先通过机械法或酶解法进行解离的样本，在进行10X仪器上机之前需要优化实验方法以确保样本达到上机标准。
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如果利用细胞核进行单细胞转录组测序或单细胞ATAC-seq研究，10xGenomics 公司也提供了相应的细胞核抽取方案（网址：https://support.10xgenomics.com/single-cell-atac/sample-prep）；
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另外，也提供了去除死细胞、裂解红细胞的方法（同时也可以使用BD等其他品牌的试剂方法）。
对于如何获得高质量的样品，10X公司建议在单细胞悬液制备过程中，细胞重悬的缓冲液选用无Ca2+、Mg2+和EDTA的1× PBS，并用0.04% non-acetylated BSA清洗两次（300rcf，5min），选择其他缓冲液或培养基可能会对结果产生不同程度的影响。
另外，对于一些原代细胞、干细胞和敏感细胞类型需最大细胞活力，必要时可用常见细胞缓冲液替换PBS。
其他缓冲液
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)
其他培养基
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) + 10% FBS
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS
Iscove’s Modified Eagle Medium (IMEM) + 10% FBS
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% FBS
Ham’s F12 + 10% FBS、1:1 DMEM/F12 +10% FBS
M199
单细胞悬液制备过程中出现的细胞团、细胞碎片或纤维等杂质会增加微流体芯片的堵塞风险。为避免这种状况，建议在上样前使用细胞滤网（cell strainer），孔径大约为30-40 μm，进行过滤。低细胞悬浮液体积建议使用Flowmi™Tip过滤，细胞悬液体积损失小，细胞浓度降低30%左右，在过滤后需要对细胞浓度进行重新计算。
常规体积建议使用MACS SmartFilter过滤，细胞悬液体积会损失100ul左右，但对细胞浓度影响不大。
目前市场上也有很多公司提供一些常规样本处理的相关试剂盒，使老师对样本的处理更加方便快捷，例如，美天旎、罗氏、Worthington 公司、Sigma-Aldrich公司 等，其公司的官方网站上均有相关产品目录、详细的方法步骤以及一些参考文献说明，方便老师阅读或后续引用。
上述的一系列方法，均需要老师根据自己样本特性来进行预实验搜索最佳条件以获得高质量细胞。总而言之，在处理不同组织时，努力摸索方法，尽可能采用对细胞损伤小、产率较高的单细胞悬液制备方法，最大限度地保持细胞原有特性。
参考文献
[1] Li, N.et al. Memory CD4(+) T cells are generated in the human fetal intestine.Nat Immunol. (2019)
[2] Miller, B.C.et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nat Immunol. (2019)
[3] MacParland,S.A.,Liu,et al. Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations. Nat communi. (2018)
[4] Zhao,Q.,Eichten,et al. Single-cell transcriptome analyses reveal endothelial cell heterogeneity in tumors and changes following anti-angiogenic treatment. Cancer Res (2018)
[5] Merav Cohen, Amir Giladi, Anna-Dorothea Gorki,et al. Lung Single-Cell Signaling Interaction Map Reveals Basophil Role in Macrophage Imprinting.cell. (2018)
[6] Fan, X.et al. Spatial transcriptomic survey of human embryonic cerebral cortex by single-cell RNA-seq analysis. Cell Res. (2018)
[7] Zeisel, A.et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. (2018)
[8] Tsurumachi, N., Akita,et al. Effect of Collagenase Concentration on The Isolation of Small Adipocytes from Human Buccal Fat Pad. J Oral Sci. (2018)
[9] Szöke,K.,Reinisch, A., Østrup,et al. Autologous Cell Sources in Therapeutic Vasculogenesis: In Vitro and In Vivo Comparison of Endothelial Colony-Forming Cells from Peripheral Blood and Endothelial Cells Isolated from Adipose Tissue. Cytotherapy. (2016)
[10] Bowles,A.C.,Strong,et al. Adipose Stromal Vascular Fraction-Mediated Improvements at Late-Stage Disease in a Murine Model of Multiple Sclerosis. Stem Cells. (2017)
[11] Kondo,T.,Toyoshima, et al. Natural Killer T Cells in Adipose Tissue are Activated in Lean Mice. Exp Anim. (2013)
[12] Estève,D.,Boulet,et al. Human White and Brite Adipogenesis is Supported by MSCA1 and is impaired by Immune Cells. (Stem Cells). 2015
[13] Matthew D.Young,Thomas J.Mitchell, Felipe A.Vieira Braga et al. Single-cell transcriptomes from human kidneys reveal the cellular identity of renal tumors. Science.(2018)
[14] Ledergor,G.,Weiner,et al. Single cell dissection of plasma cell heterogeneity in symptomatic and asymptomatic myeloma. Nat Med. (2018)
[15] Lafzi,A.,Moutinho,C., Picelli,S.& Heyn,H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nat Protoc. (2018)
