估计大家经过我前面的介绍，都对单细胞测序所了解了，但现在市面上有这么多测序平台，到底哪个更适合我的研究呢？
接下来的内容，将就五个国内外研究机构使用的“大规模单细胞测序平台”，一一解析如下问题（深度解析，文章略长）：
10x Genomics Chromium™系统
Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution
BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System
Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统
WaferGen ICELL8 Single-Cell System
它们各自的性能如何呢？
有应用领域的差别吗？
每个平台都有什么优缺点呢
1. 10x Genomics Chromium™系统
10x Genomics公司于2016年2月推出10x Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution，实现在单细胞水平进行高通量基因表达谱检测，对复杂细胞群深入分析，表征单个细胞的表达谱，避免单个细胞的异质性生物学信息被大量细胞的均质化掩盖。
经过3年的产品更新，目前10x Genomics Chromium™系统不仅可应用于单细胞转录组方向，还可以进行单细胞免疫谱分析、单细胞ATAC-seq、单细胞CNV分析、Linked-read基因组重测序、基因组denovo分析以及空间转录组分析。
（10x-product-family, 来源10x Genomics官网）
10x Chromium™单细胞测序的技术原理类似于Drop-seq，技术核心是油滴包裹的凝胶珠（Gel Bead-In-Emulsions, GEM）。
▶ GEM形成过程
其利用微流控芯片对细胞/细胞核/DNA片段进行精确区分，使每个GEM反应体系中仅有一个细胞/细胞核/DNA片段。将带有序列标签的Gel Bead、样本（大分子DNA片段、细胞、细胞核）和试剂预混液、油加载到各自的进样通道，通过微流体通道网络形成的“双十字”交叉系统，最终形成由油滴包裹的单细胞微反应体系GEMs。
（来源10x Genomics宣传资料）
▶ 10x Chromium™单细胞检测原理
10x Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution中的Gel Bead中上长满了寡聚核苷酸链，包含Barcode和UMI、测序接头和Poly（dT）序列。在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA；液体油层破坏后，cDNA后续进行文库构建，使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据。
（来源10x Genomics宣传资料）
10x Genomics单细胞转录组测序的应用领域，就目前基于该平台已发表文章来看，内容涉猎广泛，不同研究方向均有一定的应用储备。
-
肿瘤（肿瘤微环境、肿瘤细胞特征、循环肿瘤细胞、肿瘤耐药研究、肿瘤免疫治疗）
-
免疫
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发育分化（神经系统发育、脑发育等）
-
细胞图谱
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CRISPR
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传染病
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植物
评价：8.5min之内即可完成单细胞体系制备，高效获得500-80,000个细胞的捕获，单个样本细胞捕获率高达65%。与其他大规模单细胞分选平台相比，10x通量高，操作简单、快速，灵活性强，技术性能高，单个细胞成本低，可实现多样本混合。新更新的v3试剂可进行转录组-蛋白组联合分析、转录组-CRISPR联合分析。但是对细胞活性要求较高，大于80%；只能得到3’端的mRNA信息。
2. Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution
（该系统包含Illumina® Nextseq 500和Bio-Rad® ddSEQ™ Single-Cell Isolator，图片来源Bio-Rad官网）
2017年1月17日，Illumina公司和Bio-Rad实验室公司在JP摩根健康大会上发布了Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution。
原理：借助Bio-Rad的Droplet Digital™液滴分离技术，对单细胞进行隔离和编制条形码，完成单个细胞的捕获、扩增、表达谱建库，然后在Illumina NextSeq500仪器进行下游测序，从而获得单个细胞表达谱数据。
（来源：GEN_Oct0117_BioRad_DDTut_Final）
该系统还可以使用BaseSpace® 平台中的SureCell™ RNA Single-Cell App进行分析，在Illumina的云端基因组学计算环境中进行初级和中级数据分析，并使用FlowJo的SeqGeq™，研究人员能够鉴定和探索亚群和差异表达的基因，同时轻松生成可发表的图片。
Illumina®Bio-Rad®Single-Cell Sequencing Solution工作流程（来源Bio-Rad官网）
评价：操作简单、一次性可8个样本，每个样本可以得到500~10000个细胞，成本较低。但是，捕获效率低，仅为3%；只能得到3’端的mRNA信息。
3. BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System
（来源：BD-Rhapsody-Single-Cell-Analysis-System-Brochure）
BD Rhapsody™系统基于微流控芯片技术，可自动将细胞试剂和微珠以很高的精度装入微孔中，确保微孔间的互串扰限制在最低限度。
（来源：BD-Rhapsody-Single-Cell-Analysis-System-Brochure）
细胞悬液经注入孔注入后自然沉降到反应孔中，然后Beads 以相同方式由注入孔注入，即可在单个反应孔中捕获其中的细胞。Beads 上的序列结构与 10x相似，可以捕获到游离 mRNA 的 polyA 尾实现单细胞反转录、扩增、建库，单次实验可制备100-10,000个单细胞文库。该系统具有成像系统，在细胞捕获后，可直观的看到细胞捕获数、细胞状态等信息。
评价：实现多样本混合捕获，微孔板的孔数高达22万个；具备成像系统，可观察细胞相关信息；可以实现转录组-蛋白组联合分析；可根据需求定制引物，将检测范围集中在目标基因，大幅降低后续测序成本。
4. Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统
（图片来源：http://cn.fluidigm.com/products/c1-system ）
2012年6月13日，Fluidigm 在日本横滨举行的国际干细胞研究学会 (ISSCR ) 上发布了C1™ 单细胞全自动制备系统，是真正第一个实现商业化的平台。C1 系统基于Fluidigm创新的微流体技术，能够让研究者们快速可靠地分离单个细胞并进行分析。
原理：C1单细胞自动制备系统微流体技术，可以同时捕获多个单细胞（IFC：~96 cells；HT-IFC：~800 cells），在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程；然后BioMarkHD系统进行qPCR扩增，在几个小时内即可测试数以百计的单细胞中数百个基因的表达。
评价：分选单细胞之后可支持不同测序方法，可以获取到转录组的全长信息，但是通量低、单个细胞成本高。
5. WaferGen ICELL8® Single-Cell System
（图片来源：https://www.takarabio.com/products/automation-systems）
Wafergen公司开发了ICELL8 cx Single-Cell System单细胞分选平台基于微流控芯片的技术，利用WaferGen Smart Chip TE平台筛选细胞，5184个反应孔，可进行单细胞RNA测序样本的制备、扩增、表达谱建库测序、生物信息分析，可快速得到样本间的基因表达差异。
（ICELL8 single-cell RNA-seq workflow，来源：Goldstein et al. BMC Genomics (2017) 18:519）
评价：平台每次运行可分离500-1000个细胞，细胞的捕获只有效率30%，分选单细胞之后可支持不同测序方法，成本相对较低。但是，流程较繁琐，没有整合试剂，使用Takara试剂，需进行试剂优化。
放大招 | 五大平台直接比拼
现阶段，商业化的能直接购买使用的即以上5种平台，可以看出：
-
BD Rhapsody™、Fluidigm C1™、WaferGen ICELL8®均通过微孔板芯片进行单细胞反应体系制备，实现细胞间的物理间隔；而10x Chromiun™则是通过“双十字通道芯片”，产生液滴包裹的单细胞反应体系，相比之下能检测更多细胞，并且对于细胞的直径接受度也更高（＜40μm）。
-
细胞活力上，10x Chromiun™要求更高：>80%。因此在制备完单细胞悬液后，需要尽快上机制备单细胞文库，此时能及时预约到上门服务显得格外重要。
-
检测区域上，目前仅有Fluidigm C1™和WaferGen ICELL8®能检测mRNA全长，其余均只能检测3’端表达谱区域。
各个平台性能各有特色，实验中大家可根据实际需求综合考虑，选择最能满足试验需求的平台。大家如需要以上相关资料，欢迎在后台留言索取。
参考文献
1. 10x Genomics官网：https://www.10xgenomics.com/
2. Bio-Rad官网：http://www.bio-rad.com/zh-cn/category/single-cell-sample-preparation-for-ngs?ID=OKNW7Q15
3. Jennifer Chew et al., High-Throughput Single-Cell RNA-Seq of Large Cells and Nuclei: Harnessing RNA-Seq to Create Gene Expression Profiles, Genetic Engineering & Biotechnology News, October 1, 2017.
4. BD官网：http://www.bdbiosciences.com/en-us , BD Rhapsody Single Cell Analysis System Brochure.
5. Fluidigm官网：http://cn.fluidigm.com/products/c1-system
6. takarabio官网：https://www.takarabio.com/products/automation-systems
7. Goldstein LD, Chen YJ, Dunne J, et al. Massively parallel nanowell-based single-cell gene expression profiling. BMC Genomics. 2017;18(1):519估计大家经过我前面的介绍，都对单细胞测序所了解了，但现在市面上有这么多测序平台，到底哪个更适合我的研究呢？
接下来的内容，将就五个国内外研究机构使用的“大规模单细胞测序平台”，一一解析如下问题（深度解析，文章略长，文末有彩蛋哦！）：
10x Genomics Chromium™系统
Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution
BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System
Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统
WaferGen ICELL8 Single-Cell System
它们各自的性能如何呢？
有应用领域的差别吗？
每个平台都有什么优缺点呢
110x Genomics Chromium™系统
10x Genomics公司于2016年2月推出10x Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution，实现在单细胞水平进行高通量基因表达谱检测，对复杂细胞群深入分析，表征单个细胞的表达谱，避免单个细胞的异质性生物学信息被大量细胞的均质化掩盖。
经过3年的产品更新，目前10x Genomics Chromium™系统不仅可应用于单细胞转录组方向，还可以进行单细胞免疫谱分析、单细胞ATAC-seq、单细胞CNV分析、Linked-read基因组重测序、基因组denovo分析以及空间转录组分析。
（10x-product-family, 来源10x Genomics官网）
10x Chromium™单细胞测序的技术原理类似于Drop-seq，技术核心是油滴包裹的凝胶珠（Gel Bead-In-Emulsions, GEM）。
▶ GEM形成过程
其利用微流控芯片对细胞/细胞核/DNA片段进行精确区分，使每个GEM反应体系中仅有一个细胞/细胞核/DNA片段。将带有序列标签的Gel Bead、样本（大分子DNA片段、细胞、细胞核）和试剂预混液、油加载到各自的进样通道，通过微流体通道网络形成的“双十字”交叉系统，最终形成由油滴包裹的单细胞微反应体系GEMs。
（来源10x Genomics宣传资料）
▶ 10x Chromium™单细胞检测原理
10x Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution中的Gel Bead中上长满了寡聚核苷酸链，包含Barcode和UMI、测序接头和Poly（dT）序列。在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA；液体油层破坏后，cDNA后续进行文库构建，使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据。
（来源10x Genomics宣传资料）
10x Genomics单细胞转录组测序的应用领域，就目前基于该平台已发表文章来看，内容涉猎广泛，不同研究方向均有一定的应用储备。
肿瘤（肿瘤微环境、肿瘤细胞特征、循环肿瘤细胞、肿瘤耐药研究、肿瘤免疫治疗）
免疫
发育分化（神经系统发育、脑发育等）
细胞图谱
CRISPR
传染病
植物
评价：8.5min之内即可完成单细胞体系制备，高效获得500-80,000个细胞的捕获，单个样本细胞捕获率高达65%。与其他大规模单细胞分选平台相比，10x通量高，操作简单、快速，灵活性强，技术性能高，单个细胞成本低，可实现多样本混合。新更新的v3试剂可进行转录组-蛋白组联合分析、转录组-CRISPR联合分析。但是对细胞活性要求较高，大于80%；只能得到3’端的mRNA信息。
2Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution
（该系统包含Illumina® Nextseq 500和Bio-Rad® ddSEQ™ Single-Cell Isolator，图片来源Bio-Rad官网）
2017年1月17日，Illumina公司和Bio-Rad实验室公司在JP摩根健康大会上发布了Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution。
原理：借助Bio-Rad的Droplet Digital™液滴分离技术，对单细胞进行隔离和编制条形码，完成单个细胞的捕获、扩增、表达谱建库，然后在Illumina NextSeq500仪器进行下游测序，从而获得单个细胞表达谱数据。
（来源：GEN_Oct0117_BioRad_DDTut_Final）
该系统还可以使用BaseSpace® 平台中的SureCell™ RNA Single-Cell App进行分析，在Illumina的云端基因组学计算环境中进行初级和中级数据分析，并使用FlowJo的SeqGeq™，研究人员能够鉴定和探索亚群和差异表达的基因，同时轻松生成可发表的图片。
Illumina®Bio-Rad®Single-Cell Sequencing Solution工作流程（来源Bio-Rad官网）
评价：操作简单、一次性可8个样本，每个样本可以得到500~10000个细胞，成本较低。但是，捕获效率低，仅为3%；只能得到3’端的mRNA信息。
3BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System
（来源：BD-Rhapsody-Single-Cell-Analysis-System-Brochure）
BD Rhapsody™系统基于微流控芯片技术，可自动将细胞试剂和微珠以很高的精度装入微孔中，确保微孔间的互串扰限制在最低限度。
（来源：BD-Rhapsody-Single-Cell-Analysis-System-Brochure）
细胞悬液经注入孔注入后自然沉降到反应孔中，然后Beads 以相同方式由注入孔注入，即可在单个反应孔中捕获其中的细胞。Beads 上的序列结构与 10x相似，可以捕获到游离 mRNA 的 polyA 尾实现单细胞反转录、扩增、建库，单次实验可制备100-10,000个单细胞文库。该系统具有成像系统，在细胞捕获后，可直观的看到细胞捕获数、细胞状态等信息。
评价：实现多样本混合捕获，微孔板的孔数高达22万个；具备成像系统，可观察细胞相关信息；可以实现转录组-蛋白组联合分析；可根据需求定制引物，将检测范围集中在目标基因，大幅降低后续测序成本。
4Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统
（图片来源：http://cn.fluidigm.com/products/c1-system ）
2012年6月13日，Fluidigm 在日本横滨举行的国际干细胞研究学会 (ISSCR ) 上发布了C1™ 单细胞全自动制备系统，是真正第一个实现商业化的平台。C1 系统基于Fluidigm创新的微流体技术，能够让研究者们快速可靠地分离单个细胞并进行分析。
原理：C1单细胞自动制备系统微流体技术，可以同时捕获多个单细胞（IFC：~96 cells；HT-IFC：~800 cells），在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程；然后BioMarkHD系统进行qPCR扩增，在几个小时内即可测试数以百计的单细胞中数百个基因的表达。
评价：分选单细胞之后可支持不同测序方法，可以获取到转录组的全长信息，但是通量低、单个细胞成本高。
5WaferGen ICELL8® Single-Cell System
（图片来源：https://www.takarabio.com/products/automation-systems）
Wafergen公司开发了ICELL8 cx Single-Cell System单细胞分选平台基于微流控芯片的技术，利用WaferGen Smart Chip TE平台筛选细胞，5184个反应孔，可进行单细胞RNA测序样本的制备、扩增、表达谱建库测序、生物信息分析，可快速得到样本间的基因表达差异。
（ICELL8 single-cell RNA-seq workflow，来源：Goldstein et al. BMC Genomics (2017) 18:519）
评价：平台每次运行可分离500-1000个细胞，细胞的捕获只有效率30%，分选单细胞之后可支持不同测序方法，成本相对较低。但是，流程较繁琐，没有整合试剂，使用Takara试剂，需进行试剂优化。
放大招
五大平台直接比拼
现阶段，商业化的能直接购买使用的即以上5种平台，可以看出：
BD Rhapsody™、Fluidigm C1™、WaferGen ICELL8®均通过微孔板芯片进行单细胞反应体系制备，实现细胞间的物理间隔；而10x Chromiun™则是通过“双十字通道芯片”，产生液滴包裹的单细胞反应体系，相比之下能检测更多细胞，并且对于细胞的直径接受度也更高（＜40μm）。
细胞活力上，10x Chromiun™要求更高：>80%。因此在制备完单细胞悬液后，需要尽快上机制备单细胞文库，此时能及时预约到上门服务显得格外重要。
检测区域上，目前仅有Fluidigm C1™和WaferGen ICELL8®能检测mRNA全长，其余均只能检测3’端表达谱区域。
以上是对各平台的总结性概括，具体内容可查看下表。
各个平台性能各有特色，实验中大家可根据实际需求综合考虑，选择最能满足试验需求的平台。大家如需要以上相关资料，欢迎在后台留言索取。
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参考文献
1. 10x Genomics官网：https://www.10xgenomics.com/
2. Bio-Rad官网：http://www.bio-rad.com/zh-cn/category/single-cell-sample-preparation-for-ngs?ID=OKNW7Q15
3. Jennifer Chew et al., High-Throughput Single-Cell RNA-Seq of Large Cells and Nuclei: Harnessing RNA-Seq to Create Gene Expression Profiles, Genetic Engineering & Biotechnology News, October 1, 2017.
4. BD官网：http://www.bdbiosciences.com/en-us , BD Rhapsody Single Cell Analysis System Brochure.
5. Fluidigm官网：http://cn.fluidigm.com/products/c1-system
6. takarabio官网：https://www.takarabio.com/products/automation-systems
7. Goldstein LD, Chen YJ, Dunne J, et al. Massively parallel nanowell-based single-cell gene expression profiling. BMC Genomics. 2017;18(1):519
