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题目：GSK-3/CREBpathway involved in the gx-50’s effect on Alzheimer’s disease

杂志：Neuropharmacology

发表时间：2014年，IF：5.106

试验平台：Illumina Rat Ref-12 Expression BeadChip platform

一、题目

GSK-3/CREBpathway involved in the gx-50’s effect on Alzheimer’s disease

二、文章摘要

      β淀粉样蛋白的沉积是阿兹海默症（AD）主要的病理学标记。我们先前的研究证明一种新型化合物gx-50能减少大脑皮层Aβ的沉积，提高转基因痴呆小鼠的认知能力。为了进一步研究gx-50对AD的神经保护机制，我们用基因芯片技术研究了gx-50、Aβ及gx-50加Aβ分别处理原代神经元细胞后的基因表达。结果表明，gx-50和Aβ共同处理组共得到351个与AD密切相关的基因，其中217个显著上调，134个显著下调。这351个基因涉及神经传递，信号转导，神经系统发育，蛋白磷酸化和细胞凋亡等多种功能。通过通路分析，我们得到一个包含GSK-3, CREB, AKT和BDNF等基因的关键通路。随后，该通路（GSK-3/CREB）的作用在体内和体外实验中被进一步验证。WB和免疫组化结果表明gx-50增加了AKT的磷酸化，抑制了其下游蛋白GSK-3的活性，且恢复了CREB的转录活性，最终增强了CREB靶基因BDNF的表达。荧光定量PCR分析也得到了类似趋势。本研究表明gx-50可能通过GSK-3/CREB通路提高AD患者的认知能力。

三、研究背景

    据统计，2006年全世界有两千六百多万人患有阿兹海默症（AD）。预计到2050年这个数字会翻四倍，每85个人中就有一个患有AD。AD的发生和发展是一个复杂的病理学过程，是许多基因协同作用的结果。我们先前的研究结果表明，花椒属植物来源的gx-50能阻止老年痴呆鼠的神经变性。此外，我们还证明了gx-50能渗透血脑屏障，阻止Aβ诱导的神经元凋亡，减少Aβ蛋白的沉积，提高认知缺陷小鼠的学习能力等作用。然而，gx-50的作用机制仍不清楚。因此，我们利用基因芯片技术对gx-50和Aβ处理的神经元细胞进行研究，并进行了体内实验验证，旨在探索gx-50对AD神经保护的分子机制。

四、研究思路

五、研究结果

1. DEG鉴定及基因功能分析

通过差异表达分析，我们共得到351个在Aβ处理组和gx-50加Aβ处理组间存在显著差异的基因。在这些差异表达基因（DEG）中，有217个上调基因（Abca1, Akt1, Apoe, App, Clu等）和134个下调基因（A2m, Arsb, Bdnf, Cdk5, Cdk7等）。随后，我们用GeneSpring软件对这351个基因进行了聚类分析。如图1所示，不同处理组间可以清晰的显示出基因表达差异。与对照组相比，Aβ处理组的基因表达出现了显著差异，而gx-50加Aβ处理组显示出相对较小的差异倍数。gx-50组与对照组间的差异最小。这些结果表明，Aβ处理能显著改变AD相关基因的表达，gx-50能削弱Aβ诱导的基因表达变化。

 为了找到与基因表达变化相关的信号通路，我们进行了通路富集分析。分析结果表明，这些基因显著富集到了与神经形成和神经系统发育相关的通路，如MAPK，Wnt，Notch及钙信号通路等（图2A）。除此之外，我们还发现许多DEGs与GSK-3/CREB信号通路密切相关，且后期通过生物学实验进行了验证。通过Blast2GO分析，345个验证基因集合成三种标准GO分类：生物过程（BiologicalProcesses），分子功能（BiologicalProcesses）和细胞组分（Cellular Components）。结果共有1277条测序序列被注释到细胞组分分类中，其中有25.3%的序列富集到“细胞零件”中，18.1%富集到“膜结合细胞器”中（图2B）。在分子功能分类下，共有990条序列被注释，其中26.4%为“蛋白结合”，11.2%是“离子绑定”（图2C）。而在生物过程分类中，富集序列最多的是“细胞过程”和“代谢过程”（图2D）。

图1  神经元细胞差异表达基因热图

图2 351个AD相关基因的功能分析

2.   AD相关基因的表达验证

提取不同处理（对照, Aβ, gx-50, Aβ加gx-50）神经元细胞和不同处理（APP-/saline, APP-/gx-50, APP+/saline, APP+/gx-50）小鼠脑组织的总RNA，随后用荧光定量PCR技术分析8个AD特异性候选基因的表达量。结果如图3A所示，与对照组相比，Aβ处理的神经元细胞中6个基因（Akt1, Apoe, App, Creb,Gsk3b,Psen1）的表达显著上调，Ncstn和Bdnf基因显著下调。而gx-50预处理能显著抑制Aβ诱导的这种作用。体内实验的结果证实了这种趋势（图3B），在注射生理盐水的AD小鼠模型中8个候选基因的表达均发生了显著变化，而gx-50处理能显著削弱这些基因的表达变化。

图3  体内和体外8个AD相关基因的表达分析

3.   gx-50介导GSK-3/CREB信号通路的激活

前文分析结果表明，GSK-3/CREB通路参与gx-50的神经保护作用。所以我们用WB实验进一步分析该通路中AKT, GSK-3和CREB的表达。原代神经元细胞分别进行了六种处理：对照，Aβ，gx-50，Aβ加gx-50，LiCl（GSK-3抑制剂，能促进神经元的可塑性），Aβ加LiCl。细胞实验的结果如图4A所示，与对照组相比，Aβ处理的神经元中p-AKT, p-GSK-3和p-CREB的表达分别下降了31%，44%和28%。而gx-50预处理可以显著提高Aβ作用后这三个蛋白的表达。LiCl预处理也使这三个蛋白表达分别提高了77%, 69% 和83%。

这些结果表明，gx-50在GSK信号通路中有重要作用，且和LiCl的作用一致。动物实验呈现了相同的蛋白表达变化（图4B）。最后，为了可视化CREB在体内的激活状态，我们应用免疫组化技术检测了小鼠脑组织中CREB的磷酸化。结果显示，注射生理盐水的APP+-Tg小鼠的皮质和海马中p-CREB阳性神经元细胞含量较少。注射gx-50后，p-CREB阳性细胞分别增加了86%和28%（图5）。而在分别注射gx-50和生理盐水的野生型小鼠间，p-CREB的水平无显著变化。因此，gx-50在体内也可以增加p-CREB的表达水平。

图4  WB分析AKT, GSK-3和CREB的激活

图5  APP+/-Tg小鼠大脑皮层和海马的CREB磷酸化